Dosage de la réplication de Legionella pneumophila dans les macrophages prétraités avec des vésicules membranaires externes

Commencez avec une plaque multipuits contenant des macrophages prétraités exposés à des vésicules de membrane externe bactériennes de Legionella pneumophila, ou OMV.

Ajoutez Legionella pneumophila à un rapport bactérie-cellule hôte défini pour infecter les macrophages traités par OMV.

Pendant l’incubation, les macrophages internalisent les bactéries dans des phagosomes liés à la membrane.

Le

prétraitement OMV modifie la signalisation des macrophages, inhibant la maturation des phagosomes.

Cela facilite la formation d’une vacuole contenant des légionelles, qui protège les bactéries et permet la réplication intracellulaire.

Ajoutez un détergent et incubez pour lyser les macrophages. Cela libère les bactéries intracellulaires dans le milieu.

Étalez le lysat dilué sur une plaque de gélose enrichie en nutriments.

Pendant l’incubation, les bactéries se développent et forment des colonies visibles.

Comptez les colonies pour déterminer les unités formant des colonies, ou UFC, représentant le nombre de bactéries viables.

Comparez le nombre d’UFC entre les macrophages traités par OMV et ceux qui ne le sont pas.

Une UFC plus élevée chez les macrophages traités par OMV par rapport aux macrophages non traités indique que les OMV facilitent la survie de Legionella dans les macrophages.

Infecter des cellules THP-1 prétraitées ou non traitées avec le noyau B de la souche sauvage de L. pneumophila ou des cellules BMDM murines avec un mutant dépourvu de flagelle de cette souche sans modifier le milieu des cellules.

Ajouter des bactéries à un moment d’inertie de 0,5, ce qui équivaut à un fois 10 à la cinquième L. pneumophila par puits. Incuber les cultures pendant 24 et 48 heures respectivement. Pour lyser les cellules, ajoutez de la saponine à une concentration finale de 0,1 % et incubez les cellules pendant cinq minutes.

Ensuite, striez 50 microlitres des dilutions requises sur des plaques de gélose BCYE et incubez les plaques pendant trois jours.

Comptez visuellement les colonies formées à l’œil nu et effectuez les calculs selon le protocole de texte.