Procédure de récolte bactérienne et de lyse mécanique

Prenez une culture de Staphylococcus aureus, une bactérie avec une paroi cellulaire épaisse de peptidoglycane.

Diluez la culture dans un milieu frais contenant des antibiotiques et incubez-la à une température chaude en l’agitant pour favoriser la croissance bactérienne.

Transférez la culture dans un tube et centrifugez-la pour granuler les bactéries.

Jetez le surnageant et placez la pastille sur de la glace pour protéger les bactéries des dommages.

Remettre la pastille en suspension dans un tampon de lyse et la transférer dans un tube contenant des billes de silice.

Insérez le tube dans un instrument de lyse cellulaire mécanique et lancez l’agitation.

Les collisions rapides entre les bactéries et les billes génèrent des forces de cisaillement. Cela lyse les bactéries, libérant de l’ADN, de l’ARN et des complexes ARN-protéines.

Les ions dans le tampon de lyse stabilisent les structures de l’ARN, tandis que les agents réducteurs dans le tampon inactivent les enzymes dégradant l’ARN.

Maintenant, centrifugez à nouveau le mélange pour granuler les débris.

Prélever le surnageant contenant des acides nucléiques et des protéines pour une analyse plus approfondie.

Cultiver une colonie de souches portant soit l’ARNs pCN51 P3 MS2 ou les plasmides pCN51 P3 MS2 dans trois millilitres de milieu BHI complété par 10 microgrammes par microlitre d’érythromycine en doubles.

Diluer chaque culture de nuit dans 50 millilitres de milieu BHI frais complété par de l’érythromycine pour atteindre une DO 600 de 0,05. Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius en secouant à 180 tr/min pendant six heures. Transférez chaque culture dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et centrifugez les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant, congelez-les et stockez-les à moins 80 degrés Celsius ou conservez les granulés sur de la glace et effectuez directement la lyse cellulaire mécanique.

Pour effectuer la lyse mécanique des cellules, réintroduisez les pastilles dans cinq millilitres de tampon A et transférez les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres contenant 3,5 grammes de billes de silice. Insérez les tubes dans un instrument de lyse cellulaire mécanique et exécutez un cycle de 40 secondes à quatre mètres par seconde. Centrifugez les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes, puis récupérez le surnageant et maintenez-le sur de la glace.

Assurez-vous que le surnageant est clair, en répétant la centrifugation si ce n’est pas le cas.