Isolement d’ARN bactérien cible lié à un petit ARN régulateur à l’aide de la purification par affinité

Prenez un lysat cellulaire bactérien contenant des composants cellulaires, y compris de l’ARNs marqué MS2 lié à son ARN cible.

L’ARNs marqué MS2 est un petit ARN régulateur modifié portant une boucle souche aptamère MS2 à son extrémité 5′, qui présente une forte affinité pour la protéine d’enveloppe virale MS2.

Transférez le lysat bactérien dans une colonne de chromatographie d’affinité pré-équilibrée contenant de la résine amylose liée à des protéines de fusion composées de la protéine de liaison au maltose (MBP) et de la protéine d’enveloppe MS2.

La protéine d’enveloppe MS2 immobilisée capture spécifiquement la boucle souche de l’aptamère de l’ARNs marqué MS2, en conservant l’ARNs cible intact lié à l’ARN.

Les molécules non marquées qui restent non liées sont collectées dans le flux continu.

Lavez la colonne avec un tampon pour éliminer les molécules résiduelles non liées.

Élué avec un tampon contenant du maltose, qui déplace le MBP de la résine, libérant l’ARNs marqué MS2 lié à son ARN cible.

Recueillir et stocker les fractions sur de la glace afin de préserver l’intégrité de l’ARN pour l’analyse en aval.

Retirez l’embout de la colonne, puis placez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne et lavez la colonne avec de l’eau ultra-pure. Ajoutez 300 microlitres de résine amylose et lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Diluez 1 200 picamoles de protéine MBP-MS2 dans six millilitres de tampon A et chargez-le dans la colonne.

Lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Ensuite, effectuez une purification d’affinité MS2. Chargez le lysat cellulaire dans la colonne et collectez la fraction transitoire dans un tube de collecte propre. Lavez la colonne trois fois avec 10 millilitres de tampon A et collectez la fraction de lavage, puis éluez la colonne avec un millilitre de tampon E et collectez la fraction d’élution dans un microtube de deux millilitres.

Conservez toutes les fractions collectées sur de la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN.