Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:30 min • August 29th, 2025
Prenez un lysat cellulaire bactérien contenant des composants cellulaires, y compris de l’ARNs marqué MS2 lié à son ARN cible.
L’ARNs marqué MS2 est un petit ARN régulateur modifié portant une boucle souche aptamère MS2 à son extrémité 5′, qui présente une forte affinité pour la protéine d’enveloppe virale MS2.
Transférez le lysat bactérien dans une colonne de chromatographie d’affinité pré-équilibrée contenant de la résine amylose liée à des protéines de fusion composées de la protéine de liaison au maltose (MBP) et de la protéine d’enveloppe MS2.
La protéine d’enveloppe MS2 immobilisée capture spécifiquement la boucle souche de l’aptamère de l’ARNs marqué MS2, en conservant l’ARNs cible intact lié à l’ARN.
Les molécules non marquées qui restent non liées sont collectées dans le flux continu.
Lavez la colonne avec un tampon pour éliminer les molécules résiduelles non liées.
Élué avec un tampon contenant du maltose, qui déplace le MBP de la résine, libérant l’ARNs marqué MS2 lié à son ARN cible.
Recueillir et stocker les fractions sur de la glace afin de préserver l’intégrité de l’ARN pour l’analyse en aval.
Retirez l’embout de la colonne, puis placez une colonne de chromatographie dans un
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