Méthode de microdilution en bouillon pour l’antibiogramme de bactéries à Gram positif

Isolez les colonies bactériennes à Gram positif d’une plaque de culture et suspendez-les dans un milieu.

Diluer la suspension pour obtenir la concentration bactérienne optimale pour le dosage.

Inoculer les puits d’essai d’une microplaque contenant des concentrations croissantes d’un antibiotique lipoglycopeptide et d’un puits de contrôle de croissance contenant uniquement le milieu.

Étalez une aliquote du puits témoin sur des plaques de culture pour vérifier la pureté de la culture et le nombre de bactéries.

Incuber pour permettre la croissance bactérienne, au cours de laquelle la paroi cellulaire est synthétisée.

L’antibiotique se lie au peptidoglycane, un composant de la paroi cellulaire, et à ses précurseurs, inhibant la polymérisation et affaiblissant la paroi.

La perturbation permet à la pression osmotique de provoquer la lyse cellulaire.

Après l’incubation, confirmez la pureté de la culture et le nombre optimal de bactéries.

Inspectez les puits pour détecter la croissance bactérienne.

Le puits témoin montre une croissance visible, tandis que le puits d’essai avec la concentration d’antibiotiques la plus faible qui inhibe complètement la croissance indique la concentration minimale inhibitrice (CMI).

Dans cette démonstration, une assiette fraîchement préparée sera inoculée. Pour préparer l’inoculum, sélectionnez plusieurs colonies bien isolées dans une gélose au sang de 18 à 24 heures ou une autre plaque de gélose non sélective. Ici, des souches de contrôle de la qualité de S. aureus et d’E. faecalis sont utilisées.

Touchez le haut de chaque colonie avec un écouvillon stérile et transférez-en une partie dans un tube contenant un à cinq millilitres de CAMHB ou de solution saline. Continuez à transférer jusqu’à ce que la turbidité corresponde à un étalon McFarland de 0,5 dans les 15 à 30 minutes suivant la préparation, diluez l’inoculum de un à 100 dans du CAMHB pour arriver à une concentration finale de cinq fois 10 à la cinquième UFC par millilitre. La plage acceptable est de deux à huit fois 10 à la cinquième UFC par millilitre.

À l’aide d’une pipette multicanaux avec des pointes stériles, transférez immédiatement 50 microlitres de l’inoculum final dans chaque puits approprié de la plaque du panneau MIC. Ici, quatre rangées sont inoculées avec chacun des deux isolats, pour un total de quatre répétitions par isolat. Ensuite, pour effectuer un contrôle de pureté, utilisez une pipette pour transférer un à 10 microlitres de la solution dans le contrôle de croissance positive vers une gélose non sélective, telle que la gélose de soja trypticase avec 5 % de sang de mouton.

Utilisez une boucle stérile pour étaler la solution sur la surface de la plaque. Tournez la plaque à 90 degrés et striez à nouveau pour vous assurer que l’inoculum est uniformément réparti. Couvrez l’assiette et mettez-la de côté.

En préparation d’un comptage de colonie, utilisez une pipette monocanal pour transférer 10 microlitres de la solution dans le puits de contrôle de croissance à 10 millilitres de mélange salin, puis transférez 100 microlitres dans un milieu gélosé non sélectif approprié, tel que la gélose de soja trypticase avec 5 % de sang de mouton à l’aide d’une boucle stérile, étalez la solution sur toute la surface de la gélose. Répétez ce processus deux fois dans des directions différentes pour assurer une distribution uniforme de l’inoculum. Ensuite, empilez jusqu’à quatre panneaux MIC dans un récipient en plastique en veillant à ce que le panneau supérieur soit hermétiquement fermé avec un couvercle.

Placez ensuite une serviette en papier humide à l’intérieur du récipient en plastique et fermez-le solidement avec le couvercle dans les 30 minutes suivant l’inoculation. Incuber les panneaux de CMI, la plaque de comptage des colonies et la plaque de contrôle de la pureté dans un incubateur d’air ambiant à plus ou moins deux degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. Le lendemain, lisez la concentration minimale inhibitrice comme la concentration la plus faible qui inhibe complètement la croissance bactérienne dans les puits détectée à l’œil nu.

Déterminez le nombre de colonies sur la plaque de dénombrement des colonies. Multipliez le nombre compté par le facteur de dilution. Par exemple, 50 colonies multipliées par un facteur de dilution de 10 000 équivalent à cinq fois 10 puissance cinq UFC par millilitre.

Une fourchette acceptable est de 20 à 80 colonies, ce qui équivaut à deux à huit fois 10 à la cinquième colonie formant des unités par ml. La concentration de l’inoculum est une variable importante pour contrôler le test de sensibilité afin d’obtenir des résultats précis. Enfin, vérifiez la plaque de pureté.

Si toutes les colonies sont similaires aux colonies utilisées comme inoculum, alors il peut être considéré comme pur. S’il y a d’autres colonies présentes, il est possible qu’un contaminant soit présent dans le panel de CMI et l’essai doit être répété.