Visualisation médiée par des nanoparticules du remodelage endo-lysosomal dans des cellules infectées par des bactéries

Prenez une lame chambrée contenant des cellules épithéliales humaines avec des endosomes marqués par fluorescence.

Introduire des bactéries pathogènes intracellulaires et incuber, leur permettant d’adhérer aux cellules.

Les bactéries injectent des protéines qui réorganisent le cytosquelette de l’hôte, formant des protubérances membranaires qui internalisent les bactéries dans des vacuoles.

Ces vacuoles prolongent des projections tubulaires reliées au système endo-lysosomal, un réseau de vésicules et d’organites régulant le trafic intracellulaire.

Ces projections redirigent le transport des vésicules et remodèlent le système endo-lysosomal.

Laver pour éliminer les bactéries extracellulaires, puis incuber avec un milieu contenant des antibiotiques pour éliminer toutes les bactéries restantes.

Remplacez-le par un support d’imagerie sans sérum contenant l’antibiotique et ajoutez des nanoparticules marquées avec un fluorophore contrastant.

Incuber pour permettre l’entrée des nanoparticules par endocytose et l’accumulation dans les vésicules remodelées.

Laver pour éliminer les nanoparticules non internalisées, puis incuber dans un milieu d’imagerie complété par du sérum.

Les nanoparticules fluorescentes et les endosomes marqués permettent de visualiser le remodelage endo-lysosomal induit par les bactéries.

Pour commencer cette procédure, mesurez la DO 600 des bactéries sous-cultivées et diluez à une DO 600 de 0,2 dans un millilitre de PBS, ajoutez des quantités appropriées de bactéries aux cellules HeLa dans la lame de chambre à 8 puits pour obtenir une multiplicité d’infection de 100. Incuber pendant 30 minutes dans l’incubateur cellulaire.

Lavez les cellules HeLa trois fois avec du PBS pour éliminer les bactéries non internalisées. Ce point temporel est défini comme zéro heure après l’infection ou zéro heure p.i. Ajoutez 300 microlitres de milieu de culture frais contenant 100 microgrammes par millilitre de gentamicine dans les cellules et maintenez pendant une heure.

Après une heure, remplacez le support par un support d’imagerie contenant 10 microgrammes par millilitre de gentamicine. Ajouter des NPs d’or-BSA-rhodamine aux cellules HeLa pour obtenir une concentration finale de OD 520 de 0,1.

Incuber pendant une heure. Au bout d’une heure, retirez le milieu et lavez-le trois fois avec du PBS. Enfin, ajoutez 300 microlitres de milieu d’imagerie frais contenant 10 % de FCS et 10 microgrammes par millilitre de gentamicine pour le reste du temps d’incubation.