Culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer

Commencer avec une plaque de gélose contenant des colonies de Mycobacterium tuberculosis cultivées sur un milieu enrichi en nutriments.

Inoculez une seule colonie dans un bouillon enrichi en nutriments et incubez avec agitation pour une croissance uniforme.

Permettez à la culture d’atteindre la phase logarithmique tardive, où les cellules sont métaboliquement actives.

Pipetez un petit volume sur une plaque de gélose enrichie, étalez-le uniformément et incubez jusqu’à ce qu’une couche bactérienne continue se forme.

Humidifiez un écouvillon stérile avec un milieu minimal à faible teneur en fer (LIMM) et recueillez les bactéries.

Suspendez-les dans un récipient en plastique contenant des LIMM pour éviter la contamination par le fer.

Ajouter un agent dispersant pour éviter l’agglutination et incuber sans secouer.

Dans des conditions limitant le fer, les bactéries activent les réponses au stress et produisent des sidérophores dans le cytoplasme.

Ceux-ci sont emballés dans des vésicules extracellulaires et libérés dans l’environnement.

Les sidérophores capturent le fer et aident les bactéries à survivre.

Ce système met en évidence l’adaptation et la survie des mycobactéries dans des conditions limitées en fer

Inoculer une seule colonie de MTB dans deux millilitres de milieu de bouillon mycobactérien complété par un enrichissement en ADN. Incuber avec agitation à 37 degrés Celsius. Lorsqu’il y a une croissance visible, prélevez deux millilitres de la culture et mesurez la DO 540 sur un spectrophotomètre.

Arrêtez l’incubation lorsque le DO 540 atteint 0,8, ce qui indique la phase logarithmique tardive. Étalez 200 microlitres de la culture logarithmique tardive sur les plaques de gélose mycobactérienne complétées par 0,2 glycérol, 0,5 % de Tween 80 et de l’ADN. Inoculez au moins cinq plaques.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius. Et après une semaine, la croissance bactérienne est visible sous la forme d’une couche confluente. Ensuite, mouillez un coton-tige stérile dans un milieu minimal à faible teneur en fer.

Utilisez cet écouvillon pour recueillir les bactéries des plaques de gélose. Inoculez les bactéries dans 100 millilitres de milieu à faible teneur en fer dans un tube. Recueillir suffisamment de bactéries pour préparer une suspension avec une OD 540 de un.

Diluez la suspension 10 fois pour un litre avec un faible teneur en fer, un minimum de moyen, et divisez-la dans deux bouteilles en plastique stériles. Ensuite, transférez deux millilitres de la culture dans un tube de culture de cinq millilitres. Ajouter 10 microlitres de 10 % volume par volume tyloxapol.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius pendant 14 jours.