Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Commencer par des puits contenant des lymphocytes T CD4+ exprimant des récepteurs spécifiques au peptide de l’ovoalbumine ou OVAp.
Dans le puits de contrôle négatif, placez un insert de membrane poreuse.
Dans un tube, prélever des cellules dendritiques infectées par des bactéries et chargées d’OVAp pour une présentation en surface.
Ajoutez les cellules dendritiques directement dans le puits de test et dans l’insert du puits de contrôle négatif.
Ajoutez du milieu dans les puits et incuber.
Dans le puits de test, les cellules interagissent pour former une synapse immunologique, facilitant le transfert bactérien de la cellule dendritique à la cellule T, un processus connu sous le nom de transinfection.
Dans le puits de contrôle négatif, la barrière membranaire empêche l’interaction cellule-cellule, inhibant ainsi la transinfection.
Ajoutez l’antibiotique gentamicine dans les puits et incuber.
La gentamicine ne peut pas pénétrer les cellules eucaryotes, tuant ainsi uniquement les bactéries non internalisées tandis que les bactéries internalisées survivent.
L’échantillon de test contenant des lymphocytes T infectés et l’échantillon de contrôle contenant des lymphocytes T non infectés sont maintenant prêts pour l’isolement des lymphocytes T et la quantification de la transinfection.
À une plaque de culture à 24 puits, ajoutez deux millions de lymphocytes T CD4+ dans un volume de 0,5 millilitre dans chacun des cinq puits.
Ensuite, pour contrôler le contact physique, placez des barrières trans-puits en polycarbonate avec des pores de trois micromètres dans les troisième et quatrième puits. Dans le premier puits, ajoutez 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées et surchargées. Dans le deuxième puits, ajoutez 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées non chargées.
Ajoutez 0,1 millilitre de cellules dendritiques surchargées infectées dans un puits, et 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées non chargées dans l’autre puits. Enfin, en tant que témoin négatif, infecter directement le cinquième puits des lymphocytes T CD4+ à un moment d’inertie de 10. Ensuite, portez le volume total du puits à 0,6 millilitre avec RPMI.
Incuber la plaque pendant 30 minutes pour permettre la formation des synapses immunitaires. Après l’incubation, ajoutez 100 microgrammes de gentamicine par millilitre de milieu dans chaque puits et incubez pendant une heure. La gentamicine est un antibiotique aminoglycoside qui n’est pas capable de pénétrer dans les cellules eucaryotes.
Par conséquent, dans cette étape, l’aminoglycoside tuera les bactéries extracellulaires mais pas les bactéries intracellulaires.