Imagerie par fluorescence de l’infection bactérienne associée aux biomatériaux chez les embryons de poisson-zèbre

Commençons par des embryons de poisson-zèbre anesthésiés injectés avec des bactéries pathogènes marquées par fluorescence, seules ou mélangées à des microsphères de biomatériaux, pour modéliser in vivo l’infection associée aux biomatériaux.

Placez une boîte de Pétri contenant un média basal avec anesthésique sur la platine d’un microscope à stéréofluorescence équipé de filtres appropriés.

Ajoutez une solution de méthylcellulose dans la boîte pour créer un milieu visqueux qui immobilise les embryons pour l’imagerie.

Transférez les embryons individuels dans la méthylcellulose et alignez-les horizontalement, en veillant à ce que le site d’injection soit visible.

À l’aide du filtre à fond clair, concentrez-vous sur le site d’injection pour cibler la région infectée.

Réglez les paramètres d’imagerie Z-stack et acquérez des images de fluorescence à différentes profondeurs pour capturer la dynamique de l’infection en trois dimensions.

À l’aide d’un logiciel, analysez les images capturées au fil du temps pour quantifier l’intensité de la fluorescence et surveiller la distribution bactérienne.

Ce protocole permet une comparaison directe de la progression de l’infection chez les embryons vivants avec et sans exposition aux biomatériaux.

Placez une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du milieu E3 complété par 0,02 % de tricaïne sur une platine de microscope à stéréofluorescence, et ajoutez 500 microlitres de méthylcellulose à 2 % dans la boîte de Pétri. Pour surveiller la progression de l’infection par microscopie à fluorescence, équipez-vous des filtres à fond clair et fluorescents appropriés, alignez horizontalement les embryons infectés anesthésiés dans un point de méthylcellulose dans une boîte de Pétri.

Utilisez le filtre à fond clair pour faire la mise au point sur le tissu injecté endommagé à un grossissement de 160x. Réglez la profondeur de l’empilement Z à 10 micromètres et la taille du pas à cinq micromètres pour permettre l’enregistrement de trois images consécutives. Ensuite, imaginez les embryons individuels dans des paramètres optimisés identiques à un grossissement de 160x.

Utilisez le plugin ObjectJ dans ImageJ pour analyser les images.