Analyse in vivo d’infections bactériennes associées à des implants à l’aide d’embryons de poisson-zèbre

Commencez par un plat contenant une chambre d’agarose moulée avec des rainures.

Chaque rainure contient des embryons de poisson-zèbre anesthésiés immergés dans un milieu embryonnaire complété par un agent anesthésique.

Au microscope optique, insérez une aiguille de micro-injection dans le tissu musculaire.

Injecter une suspension contenant des microsphères de S. aureus et de polystyrène pour modéliser une infection associée à l’implant.

Transférez les embryons injectés dans des puits individuels d’une plaque multi-puits remplie d’un milieu frais et incuberez.

Les microsphères offrent une surface physique qui favorise la colonisation bactérienne et favorise l’infection.

Pour évaluer l’infection bactérienne associée à l’implant, transférez chaque embryon dans un tube séparé et lavez-le avec un tampon. Ajoutez un tampon et des perles de céramique.

Homogénéiser pour lyser les embryons et libérer le contenu interne, y compris les bactéries.

Plaquez les homogénats dilués, puis incubez pour permettre la formation de la colonie.

Les embryons injectés avec la suspension microsphère-bactérie présentent un nombre de colonies plus élevé que ceux injectés avec la suspension bactérienne seule. Cela indique que les microsphères augmentent la sensibilité aux infections.

Après avoir attendu cinq minutes pour que les embryons soient anesthésiés, alignez les embryons dans les rainures dans une seule orientation pour leur injection. Réglez le micro-injecteur sur les paramètres d’injection appropriés et insérez l’aiguille dans le tissu musculaire du premier embryon à un angle de 45 à 60 degrés sous un stéréomicroscope.

Déplacez doucement l’aiguille d’avant en arrière pour ajuster la position dans le tissu si nécessaire, et utilisez la pédale du micro-injecteur pour injecter la suspension chargée. Lors de l’injection d’une suspension de microsphère de bactérie dans le tissu d’embryons de poisson-zèbre, l’aiguille doit être insérée doucement mais avec une main ferme. Après une insertion réussie, un espace doit être créé pour les matériaux avant l’injection.

Et maintenez les embryons dans un milieu E3 sans tricaïne dans des puits individuels de plaques de 48 puits avec des changements quotidiens de milieu. Pour surveiller la progression de l’infection par quantification d’unités formant des colonies, transférez au hasard cinq à six embryons infectés viables dans des microtubes individuels de deux millilitres peu de temps après l’injection, et lavez doucement les embryons avec du PBS stérile. Après avoir jeté les lavages, ajoutez 100 microlitres de PBS stérile dans chaque tube, suivis de deux à trois billes de zircone stériles de deux millimètres de diamètre.

Ensuite, écrasez les embryons dans un homogénéisateur à 3 500 tr/min pendant 30 secondes et cultivez l’homogénat comme indiqué.