Quantification des amyloïdes induites par une infection bactérienne à l’aide de la fluorescence T de thioflavine

Prenez une cuvette contenant une solution de travail de thioflavine T, un colorant fluorescent spécifique de l’amyloïde, dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate.

Placez la cuvette dans un spectrofluorimètre et enregistrez le signal de fluorescence de base.

Mettez le balayage en pause et retirez la cuvette.

Ajouter le surnageant de culture stérilisé par filtre prélevé sur des cellules endothéliales pulmonaires infectées par des bactéries Pseudomonas virulentes.

Le surnageant contient des agrégats amyloïdes, qui sont des protéines mal repliées et riches en feuillets bêta.

Mélangez doucement le contenu par inversion pour assurer une répartition uniforme.

Rechargez la cuvette dans le spectrofluorimètre et reprenez le balayage pour acquérir un signal de fluorescence basé sur le temps.

La thioflavine T se lie spécifiquement aux amyloïdes riches en feuillets bêta, ce qui conduit à une fluorescence accrue.

Effectuez un balayage de fluorescence en utilisant les mêmes paramètres.

Une augmentation de la fluorescence par rapport à la ligne de base indique la présence et l’abondance relative d’amyloïdes induites par l’infection dans le surnageant de culture.

Pour quantifier les amyloïdes dans le surnageant, ajoutez 20 microlitres de solution mère de thioflavine T 50X fraîchement préparée et filtrée à un millilitre de PBS dans une cuvette de spectrophotomètre d’un millilitre, et chargez l’échantillon dilué sur un spectrofluorimètre.

Mesurez l’émission de fluorescence de base à l’aide d’une excitation de 425 nanomètres. Balayage de l’émission de fluorescence de 450 à 575 nanomètres par incréments de deux nanomètres. Ensuite, réglez l’instrument pour effectuer un balayage en accéléré à l’aide d’une excitation de 425 nanomètres et d’une émission de 482 nanomètres avec acquisition de données toutes les 0,2 seconde pendant 60 secondes.

Interrompez le balayage après 20 secondes et ajoutez 10 microlitres de surnageant stérilisé par filtre dans la cuvette. Après le mélange par inversion, rechargez la cuvette sur le spectrofluorimètre et reprenez le balayage temporel pendant les 40 dernières secondes. Une fois le laps de temps terminé, effectuez un balayage final du spectre des émissions de fluorescence en utilisant les paramètres de balayage d’origine.