Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Commencer par une culture de Pseudomonas aeruginosa recombinant dans un milieu de sélection d’antibiotiques.
Ces bactéries hébergent un plasmide non réplicatif intégré dans le génome à proximité du gène cible bactérien destiné à la délétion.
L’intégration s’est produite via des séquences homologues partagées entre le plasmide et le génome, ce qui a entraîné une recombinaison croisée unique.
Le plasmide code pour un gène de résistance aux antibiotiques et le gène sacB , qui confère une sensibilité au saccharose.
Étalez les bactéries sur un milieu contenant du saccharose mais sans l’antibiotique et incubez.
En l’absence de pression antibiotique, une seconde recombinaison, ou double croisement, se produit entre les régions homologues, excisant le plasmide et le gène cible.
Lors de la multiplication bactérienne, le plasmide excisé n’est pas transmis, ce qui rend la bactérie tolérante au saccharose.
Appliquez les bactéries sur un milieu non sélectif et un milieu contenant du saccharose ou l’antibiotique, puis incuberez.
La croissance sur le milieu non sélectif et le milieu saccharose, mais pas sur le milieu antibiotique, confirme un double croisement réussi.
Commencez par cultiver des colonies recombinantes à croisement unique dans le bouillon d’isolement Pseudomonas , ou PIB. Inoculez et striez 10 microlitres de chaque culture sur des plaques PIA préchauffées, complétées par 10 % de saccharose. Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, retirez les plaques de l’incubateur et inspectez-les pour leur croissance. La colonie résistante au saccharose doit être composée de recombinants à double croisement. Utilisez des cure-dents stériles pour patcher au moins 20 colonies sur des plaques préchauffées de PIA, de PIA supplémenté avec 10 % de saccharose et de PIA complété avec de la carbénicilline.
Incuber les plaques pendant la nuit et les examiner pour leur croissance le lendemain. Les véritables recombinants à double croisement seront sensibles à la carbénicilline et résistants au saccharose.