Imagerie par fluorescence du cycle de vie de Streptomyces venezuelae

Prenez une plaque microfluidique avec un puits contenant des spores de Streptomyces venezuelae, une bactérie formant des hyphes.

D’autres puits désignés contiennent soit du milieu riche en nutriments, soit du milieu épuisé.

Les spores sont dérivées d’une souche exprimant les protéines fluorescentes DivIVA et FtsZ, qui se localisent respectivement aux extrémités des hyphes et aux parois transversales.

Appliquez de l’huile d’immersion sur l’objectif d’un microscope inversé et sur la fenêtre d’imagerie de la plaque.

Montez la plaque sur la platine du microscope et commencez l’imagerie en accéléré.

Chargez les spores dans la chambre de culture de la plaque.

Ensuite, introduisez le milieu riche en nutriments pour initier la germination des spores.

Au fur et à mesure que les hyphes grandissent, DivIVA s’accumule aux extrémités des hyphes, tandis que FtsZ forme des anneaux dispersés aux parois transversales.

Ensuite, passez au support usé. Le manque de nutriments dans ce milieu favorise la sporulation.

Dans les hyphes en germination, les foyers DivIVA disparaissent et FtsZ se réorganise en une échelle régulière d’anneaux de division, formant des septa de sporulation.

Au fil du temps, la disparition de la fluorescence FtsZ dans les mêmes hyphes confirme l’achèvement de la sporulation.

Préchauffez la chambre environnementale à 30 degrés Celsius à l’avance.

Allumez ensuite le microscope et le logiciel de contrôle du microscope. Mettez en place un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique et confirmez que les filtres et les miroirs schématiques appropriés pour acquérir des images de contraste interférentiel différentiel, ainsi que les images des fusions de protéines fluorescentes jaunes et rouges fluorescentes sont en place. Placez une goutte d’huile d’immersion dans l’objectif et au bas de la fenêtre d’imagerie sur la plaque microfluidique également.

Montez soigneusement le dispositif microfluidique scellé sur la platine du microscope inversé et fixez-le en place. Utilisez les marqueurs de position intégrés pour mettre au point la fenêtre d’imagerie de la chambre de culture microfluidique. Concentrez-vous sur la partie la plus à gauche de la première chambre d’écoulement étiquetée A, puis déplacez la platine jusqu’à la taille du piège cinq, correspondant à la hauteur du piège de 0,7 micromètre.

Dans le logiciel microfluidique, réglez le système pour charger les cellules du puits d’entrée huit à quatre psi pendant 15 secondes. Une fois le processus exécuté, vérifiez la densité cellulaire dans la chambre de culture en déplaçant la platine sur la fenêtre d’imagerie. Si aucune spores n’a été piégée, répétez l’étape de chargement cellulaire ou, alternativement, augmentez la pression et/ou le temps de chargement jusqu’à ce que la densité cellulaire souhaitée de une à 10 spores par fenêtre d’imagerie soit atteinte.

Veillez à ne pas surcharger la chambre de culture. Ensuite, démarrez le programme d’écoulement précédemment préparé dans le logiciel de contrôle et laissez la plaque microfluidique s’équilibrer en chaleur pendant une heure au stade du microscope avant de commencer l’acquisition d’images. Dans le logiciel de contrôle du microscope, configurez une acquisition multidimensionnelle pour prendre plusieurs images à plusieurs positions de platine au fil du temps en spécifiant d’abord un répertoire pour l’enregistrement automatique des fichiers d’image.

Ensuite, allez dans les paramètres d’éclairage et entrez des paramètres d’éclairage optimaux prédéterminés pour chaque construction spécifique. Ensuite, configurez une série chronologique pour acquérir des images toutes les 40 minutes pendant 24 heures. Afin de déterminer les positions de platine et de régler l’autofocus, scannez la chambre de culture et enregistrez les positions de platine pour chaque position d’imagerie d’intérêt.

Assurez-vous que les positions à un étage sont suffisamment éloignées les unes des autres pour minimiser le photoblanchiment et la phototoxicité. Une fois que les coordonnées Z des positions de scène sélectionnées sont vérifiées, activez l’autofocus matériel. Démarrez ensuite l’expérience time-lapse dans le logiciel de contrôle du microscope.

Arrêtez l’acquisition de l’image au bout de 24 à 30 heures, ou lorsque les hyphes de la région d’intérêt se sont différenciés en spores. Arrêtez ensuite le programme de flux dans le logiciel et démontez le dispositif microfluidique. Préparez la plaque microfluidique utilisée pour le stockage à court terme en retirant tout fluide restant des puits d’entrée, du puits de déchets et du puits de chargement de la cellule.

Remplissez ensuite les puits utilisés de la voie A et les puits des voies inutilisées avec du PBS stérile. Enfin, scellez la plaque avec un film de poire pour éviter qu’elle ne se dessèche. Et conservez l’assiette à quatre degrés Celsius.