Surveillance de l’infection bactérienne et de l’administration de protéines effectrices dans les cellules végétales

Commençons par une plante expérimentale avec des régions foliaires génétiquement modifiées exprimant de gros fragments non fluorescents de la protéine fluorescente verte superfolder ou sfGFP.

Injectez dans ces zones modifiées des bactéries Pseudomonas contenant des protéines effectrices marquées avec le petit fragment non fluorescent de sfGFP.

Incuber pour permettre l’interaction entre les bactéries et les cellules des feuilles.

À l’aide d’un système de sécrétion spécialisé, Pseudomonas délivre les protéines effectrices marquées dans le cytosol de la feuille.

La proximité entre les grands et les petits fragments de GFP permet leur assemblage en sfGFP fluorescente fonctionnelle, qui se déplace ensuite vers la membrane plasmique.

Après l’incubation, excisez les disques foliaires des zones injectées.

Visualisez ces disques à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Dans un premier temps, imagez le disque foliaire à faible intensité laser pour minimiser l’autofluorescence. Ensuite, augmentez la puissance du laser pour améliorer la visibilité.

La fluorescence verte confirme le succès de l’infection bactérienne et de l’administration de protéines effectrices dans les cellules végétales.

Pour les feuilles de Nicotiana benthamiana, infiltrez la suspension de Pseudomonas dans la même zone que l’Agrobacterium a été infiltrée deux jours plus tôt.

Enfin, découpez un disque foliaire dans les feuilles inoculées à Pseudomonas. À des moments précis après l’infiltration de Pseudomonas, utilisez un système de balayage laser confocal pour imager deux disques foliaires de deux centimètres carrés à partir d’une seule plante. Observez les cellules loin du trou d’infiltration pour éviter les cellules mortes tuées par les blessures.

Les effecteurs disloqués de la bactérie ne sont présents qu’en très petites quantités. Par conséquent, vous pouvez augmenter la puissance du laser et obtenir une émission de fluorescence pour détecter un signal fluorescent. Cependant, ne surchargez pas pour éviter de capturer un faux signal d’autofluorescence des cellules végétales.