Livraison localisée de bactéries dans la lumière intestinale d’une larve de poisson-zèbre par micro-injection

Prenez une coupelle contenant une larve de poisson-zèbre anesthésiée.

Appliquez une goutte d’agarose à faible point de fusion sur la larve et positionnez-la doucement latéralement pour permettre l’accès intestinal pendant l’injection.

Maintenant, refroidissez brièvement l’agarose pour la solidifier, immobilisant ainsi la larve.

Ajouter un milieu contenant un agent anesthésique pour maintenir la larve sous anesthésie.

Ensuite, prenez une suspension de Clostridioides difficile marquée par fluorescence, une bactérie pathogène, et ajoutez un colorant traceur pour faciliter le suivi de l’injection.

Chargez ce mélange dans une aiguille de micro-injection et montez l’aiguille sur un micromanipulateur.

Sous un stéréomicroscope, positionnez l’aiguille à un angle dirigé vers l’intestin larvaire.

Ensuite, insérez doucement la pointe de l’aiguille dans la lumière intestinale.

Injectez les bactéries directement dans la lumière et confirmez la réussite de l’accouchement à l’aide du colorant traceur. Ensuite, rétractez l’aiguille.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, confirmer la localisation de Clostridioides difficile dans l’intestin larvaire.

Tout d’abord, placez une goutte d’agarose à faible point de fusion à 0,8 % sur les larves de poisson-zèbre dans une boîte de Pétri pour couvrir. Ajustez doucement les larves en position latérale. Placez la boîte de Pétri sur de la glace pendant 30 à 60 secondes pour permettre à l’agarose à faible point de fusion de se solidifier.

Ajouter 30 % de milieu Danieau, contenant de 0,02 % à 0,04 % de tricaïne, pour couvrir l’agarose. Pour préparer la solution injectable, ajoutez un microlitre de rouge de phénol à 0,5 % dans une solution de PBS dans neuf microlitres d’inoculum de Clostridioides difficile coloré par colorant. Chargez une aiguille de micro-injection calibrée avec la solution d’injection à l’aide d’un Microloader.

Montez l’aiguille chargée dans un micromanipulateur et placez-la sous un stéréomicroscope. Ajustez la pression d’injection entre 600 et 900 hectopascals. Réglez le temps d’injection à 0,1 à 0,3 seconde pour obtenir 0,5 à 1,0 nanolitres.

Placez l’aiguille dans le micromanipulateur à un angle d’environ 45 degrés, pointant vers les larves incrustées. Placez la pointe de l’aiguille au-dessus du tractus gastro-intestinal, près du pore urogénital. Percez l’agarose, puis le muscle avec la pointe de l’aiguille.

Ensuite, insérez-le dans la lumière intestinale et injectez 0,5 à 1,0 nanolitre de Clostridioides difficile. Utilisez un microscope à fluorescence pour surveiller les larves injectées et utilisez une pointe flexible de microchargeur pour prélever les larves correctement injectées pour l’imagerie confocale.