Isolement de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir d’un échantillon d’eau pour analyse moléculaire

0 views • 3:16 min • September 26th, 2025

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Commencez par un échantillon d’eau contenant des bactéries d’origine hydrique et filtrez-le pour éliminer les débris.

Transférez le filtrat dilué sur des plaques de gélose à faible teneur en nutriments, chacune complétée par un antibiotique spécifique. Étalez le filtrat et incuberez.

Les bactéries porteuses d’un gène spécifique de résistance aux antibiotiques se développent sur les plaques d’antibiotiques correspondantes et forment des colonies.

Comptez les colonies pour déterminer les unités formant colonies (UFC), représentant le nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques.

Sélectionnez une seule colonie dans chaque assiette et suspendez-la dans de l’eau distillée stérile.

Chauffez la suspension pour lyser les cellules et libérer le contenu intracellulaire, y compris l’ADN bactérien qui contient le gène de résistance aux antibiotiques.

Centrifugez les tubes pour séparer les débris et recueillir le surnageant contenant de l’ADN.

Ajoutez des réactifs d’amplification à l’ADN extrait.

Placez les tubes dans un thermocycleur et exécutez le programme pour amplifier une région spécifique de l’ADN bactérien.

L’ADN amplifié est prêt pour l’analyse de séquence afin d’identifier le gène de résistance aux antibiotiques.

Traitez l’échantillon d’eau de manière aseptique en le filtrant à travers un chiffon en mousseline stérile pour éliminer toute matière particulaire. Ensuite, diluez en série l’échantillon d’eau filtrée pour une analyse plus approfondie. Pour déterminer le nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques, ajoutez les antibiotiques séparément dans des tubes contenant 20 millilitres de gélose R2A fondue stérile modifiée à environ 40 degrés Celsius.

Agitez pour mélanger uniformément et versez sur des plaques de Pétri stériles avant que la gélose ne se solidifie. Étalez 100 microlitres de suspension bactérienne sur leurs antibiotiques respectifs contenant des plaques modifiées à la gélose R2A. Incuber les plaques à 35 à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, puis déterminer le nombre de bactéries.

Pour préparer la matrice d’ADN des isolats pour la PCR, à l’aide d’un cure-dent stérile, prélevez une seule colonie pure isolée de l’isolat qui se développe sur une plaque de Pétri. Suspendez la colonie bactérienne dans 100 microlitres d’eau stérile double distillée dans un micro tube à centrifuger et faites-la bouillir dans un bain d’eau bouillante ou un bain sec pendant 10 minutes à 100 degrés Celsius. Centrifugez la suspension à 10 000 g pendant deux minutes pour granuler les débris et transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais et stérile à utiliser comme matrice d’ADN brut.

Pour amplifier la région V3 du gène de l’ARNr 16S par PCR, préparez 40 microlitres du mélange réactionnel dans un tube PCR. Placez le tube dans le bloc thermique et exécutez le programme approprié dans le thermocycleur PCR.

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Last updated: 11 July 2026