JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:28 min • September 26th, 2025
Prendre un réservoir contenant un milieu de croissance stérile au pH acide.
Transférez un grillage avec des semis de plantes dans le réservoir.
Scellez avec un couvercle et du ruban adhésif poreux pour maintenir la stérilité tout en permettant l’échange gazeux.
Incuber en secouant pour aérer le milieu.
Inspectez le milieu pour vérifier l’absence de turbidité, indiquant qu’il n’y a pas de contamination bactérienne.
Repérez un échantillon sur une plaque de culture et incubez-le pour observer l’absence de croissance bactérienne, confirmant ainsi l’absence de bactéries contaminantes.
Inoculer avec Agrobacterium, un agent pathogène des plantes, et incuber.
Les molécules de signalisation dérivées des racines des plantes et le pH acide activent une protéine capteur liée à la membrane bactérienne.
L’activation induit l’expression des gènes, produisant des protéines pour la fixation bactérienne aux surfaces racinaires.
Après la fixation, Agrobacterium délivre un fragment d’ADN, connu sous le nom d’ADN de transfert (ADN-T), dans les cellules végétales via un système de sécrétion.
Lors de l’intégration dans le génome de la plante, l’ADN-T synthétise des molécules de signalisation qui améliorent la colonisation bactérienne.
Dans une hotte à écoulement stérilisée, versez 18 millilitres de fluide MS liquide autoclavé dans des réservoirs en verre cylindriques stériles avec des couvercles stériles.
Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, transférez doucement chaque carré de maille avec des semis âgés de 10 à 14 jours de la boîte de Pétri de milieu semi-solide vers un réservoir cylindrique hydroponique. Les semis présentés ici sont de la luzerne. Scellez les couvercles sur les réservoirs à l’aide d’un ruban chirurgical poreux.
Ensuite, cultivez les plants à 22 à 24 degrés Celsius avec une photopériode de 16 heures et une agitation à 50 tr/min. Avant l’inoculation, examinez soigneusement le réservoir contenant les semis pour détecter toute contamination potentielle. Le fluide dans les réservoirs non contaminés doit être clair et transparent.
Si les réservoirs sont troubles et contaminés, jetez-les et numérotez le reste des réservoirs. Prélevez 20 microlitres de milieu hydroponique dans chaque réservoir numéroté et repérez-le sur une boîte de Pétri avec du bouillon Luria ou de l’agar LB. Incuber le plat à 28 degrés Celsius pendant 28 heures.
Inoculez immédiatement chaque réservoir hydroponique numéroté avec 50 microlitres de suspension d’Agrobacterium tumefacians dans chaque réservoir hydroponique numéroté. Co-cultivez les plantules et la bactérie A. tumefacians à 22 à 24 degrés Celsius avec une photopériode de 16 heures et une agitation à 50 tr/min. Examinez la plaque LB tachetée après 12 et 28 heures d’incubation pour vérifier la stérilité du milieu de croissance hydroponique.
S’il y a une contamination, n’utilisez pas le réservoir numéroté correspondant inoculé avec des bactéries pour d’autres essais en aval.