Préparation des sphéroplastes d’E. coli

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiologie

0 vues • 4:30 min • September 26th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenez une culture d’E. coli .

Diluez la culture dans un milieu frais et incubez-la pour favoriser la division bactérienne.

Ensuite, diluez la culture dans un milieu contenant un inhibiteur de division bactérienne et incubez.

Les bactéries continuent de croître sans se diviser, formant des filaments allongés.

Transférez la culture dans un tube frais, puis centrifugez-la pour granuler les filaments et retirer le surnageant.

Lavez le granulé avec un stabilisateur osmotique pour éviter la lyse du sphéroplaste. Retirez la solution.

Ajoutez du tampon, du lysozyme, de la DNase et un agent chélateur séquentiellement. Couver.

L’agent chélateur déstabilise la membrane externe du filament.

Le lysozyme dégrade la couche de peptidoglycane exposée, ce qui fait perdre la forme des filaments et former des structures sphériques appelées sphéroplastes.

De plus, la DNase dégrade l’ADN contaminant libéré par les filaments endommagés.

Ajoutez à nouveau le stabilisateur osmotique, mélangez et incuberez.

Transférez la suspension dans un tube contenant un tampon et une centrifugeuse.

Éliminer l’excès de surnageant et remettre les sphéroplastes en suspension dans le tampon pour l’analyse en aval.

Pour mettre en place une culture de nuit, utilisez une pointe de micropipette stérile pour transférer une seule colonie bactérienne d’une plaque de culture de gélose solide dans un tube de culture de 14 millilitres, contenant deux à trois millilitres de bouillon de soja à trois pour cent de trypticase, TSB, pour une incubation de 16 à 21 heures à 37 degrés Celsius avec agitation. Pour préparer des sphéroplastes à E . coli à Gram négatif, diluez la culture de nuit dans un rapport de un à 100 et 25 millilitres de TSB dans une fiole de 250 millilitres, puis remettez les bactéries dans l’incubateur pendant 2,5 heures supplémentaires. Lorsque la solution a atteint une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nanomètres, diluer la culture dans un rapport de un à dix dans du TSB frais dans un nouveau ballon de 250 millilitres pour une deuxième incubation de 2,5 heures avec une concentration effective finale de 60 microgrammes par millilitre de céphalexine.

Pour produire des filaments unicellulaires d’environ 50 à 150 micromètres de longueur, tels que visualisés au microscope optique à un grossissement de 1000x. Centrifuger la solution bactérienne pour récolter les filaments et décanter le surnageant. Lavez les filaments avec l’ajout doux d’un millilitre de saccharose 0,8 molaire, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.

Au bout d’une minute, jetez le surnageant sans déranger la pastille et ajoutez les réactifs indiqués dans leur ordre respectif aux filaments. Après dix minutes à température ambiante, ajoutez progressivement un millilitre de solution A sur une période d’une minute, tout en remuant doucement la solution à la main. Incuber la solution pendant quatre minutes à température ambiante, puis diviser la suspension du filament en deux aliquotes égales entre deux tubes coniques de 15 millilitres contenant sept millilitres de solution B à quatre degrés Celsius. Ensuite, granulez les filaments par centrifugation et utilisez une pipette sérologique pour retirer soigneusement tous les millilitres de surnageant sauf un à deux millilitres sans déranger les granules.

À l’aide d’une micropipette p1000, les granulés sont remis en suspension délicatement. Vérifiez une petite aliquote de l’échantillon pour la formation de sphéroplaste par microscopie optique. Le sphéroplaste peut ensuite être stocké à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine ou jusqu’à ce qu’il ait subi trois cycles de congélation et de dégel.

07:59

Extraction et visualisation d’agrégats protéiques après traitement d’Escherichia coli avec un facteur de stress protéotoxique

Vidéos connexes

0 Vues

12:29

Analyse de population et de cellules uniques de la persistance des antibiotiques chez Escherichia coli

Vidéos connexes

0 Vues

15:00

Transferts quotidiens, archivage des populations et mesure de la valeur adaptative dans l’expérience d’évolution à long terme avec Escherichia coli

Vidéos connexes

0 Vues

03:33

Préparation et transformation de bactéries par électroporation à haute tension

Vidéos connexes

0 Vues

04:02

Génération de sphéroplastes à partir de bactéries à Gram négatif

Vidéos connexes

0 Vues

07:10

Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes

Vidéos connexes

0 Vues

11:19

Induire un blocage du site de réplication spécifique dans E. coli Utilisation d'un système fluorescent répresseur opérateur

Vidéos connexes

0 Vues

12:28

Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d'une bibliothèque de fragments d'anticorps

Vidéos connexes

0 Vues

10:34

Absorption des métaux essentielle chez les bactéries Gram-négatives : x-Ray Fluorescence, radio-isotopes et fractionnement de cellules

Vidéos connexes

0 Vues

11:46

Production de protéine élastine Hydrogels pour Encapsulation et immunomarquage des cellules en 3D

Vidéos connexes

0 Vues

Dernière mise à jour : 22 août 2026