Étude de la réponse bactérienne à l’éthylène à l’aide d’un composé libérant de l’éthylène

Commencez avec une plaque multi-puits contenant un milieu de croissance pré-inoculé avec des bactéries productrices de cellulose.

Dans le puits traité, le milieu est complété par de l’acide 2-chloroéthylphosphonique (CEPA).

Scellez la plaque pour éviter les échanges gazeux et l’incincubation.

Pendant l’incubation, CEPA hydrolyse et libère de l’éthylène, une molécule gazeuse.

L’éthylène active la cellulose synthase bactérienne, qui utilise l’UDP-glucose cytosolique pour synthétiser la cellulose.

Au fil du temps, les bactéries extrudent de la cellulose à travers leur membrane.

Cela favorise l’auto-assemblage bactérien à l’interface air-liquide, formant un biofilm flottant à base de cellulose, ou pellicule.

Après l’incubation, transférez les pellicules dans une nouvelle assiette multi-puits. Ajoutez une solution alcaline et incubez à une température plus élevée pour lyser les cellules.

Retirez la solution alcaline. Laver à plusieurs reprises en agitant pour éliminer les débris cellulaires tout en conservant la cellulose.

Séchez et pesez les pellicules. Un poids sec plus élevé dans les échantillons traités par CEPA par rapport au témoin indique une production accrue de cellulose bactérienne en réponse à l’éthylène.

Le dosage des pellicules est un outil d’analyse standard pour la production de cellulose bactérienne. L’analyse de la PH et de la morphologie est détaillée dans le protocole textuel. En préparation, prélevez en trois exemplaires les cellules des cultures de démarrage et quantifiez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Petroff-Hauser.

Ensuite, préparez quatre mélanges mères moyens avec différentes concentrations CESP. Pour chaque mélange maître, aliquote 60 millilitres de milieu de pH 7 SH et ajouter 120 microlitres de solution mère CEPA 0, 5, 50 ou 500 millimolaires pour obtenir des concentrations finales CEPA de 0, 0,01, 0,1 ou 1,0 millimolaire. Mélangez ces milieux en faisant tourner les flacons.

Un ensemble de milieux est nécessaire pour chacun des triplets et un quatrième ensemble est nécessaire pour fonctionner comme un contrôle stérile. Divisez donc chaque préparation de milieu de 60 millilitres en quatre aliquotes de 14 millilitres. Ensuite, pré-refroidissez les aliquotes de 14 millilitres avant d’inoculer avec leurs cultures de démarrage respectives pour une concentration finale de 100 000 cellules par millilitre.

Gardez tous les tubes inoculés sur de la glace pour éviter la production de cellulose. Utilisez les aliquotes restantes de 14 millilitres pour les puits de contrôle stériles. Maintenant, à partir de chaque mélange maître de 14 millilitres, chargez deux aliquotes de millilitres dans six puits d’une plaque stérile de 24 puits, pour un total de quatre plaques chargées par culture de démarrage analysée.

Fermez soigneusement les plaques avec un film de paraffine et incubez-les statiquement pendant sept jours à 30 degrés Celsius. Pour prélever une pellicule de la plaque, appuyez sur un côté de la pellicule pour élever le bord opposé et ramassez-la avec une pince.

Ensuite, transférez individuellement les pellicules dans les puits d’une plaque à six puits. Traitez-les avec 12 millilitres d’hydroxyde de sodium normal 0,1 à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes pour lyser les cellules. Ensuite, retirez l’hydroxyde de sodium et neutralisez les pellicules traitées en les lavant soigneusement avec 12 millilitres d’eau ultra pure pendant 24 heures avec agitation dans une plaque à six puits.

Pendant cette incubation, changez l’eau toutes les six heures. Lorsque l’incubation est terminée, les pellicules doivent être blanches. Ensuite, placez les pellicules sur des tapis en silicone et séchez-les à 50 degrés Celsius pendant 48 heures pour les préparer à la mesure du poids sec.