Amplification d’un plasmide suicide chez un hôte bactérien

Commencez par une pastille bactérienne. Les bactéries contiennent un gène codant pour une protéine initiatrice, mais n’ont pas de gène de résistance aux antibiotiques.

Remettez la pastille en suspension dans de l’eau glacée pour minimiser la dégradation cellulaire.

Prenez un plasmide porteur d’un gène de résistance aux antibiotiques et d’un gène cible. Ce plasmide est appelé plasmide suicide car il ne peut pas se répliquer sans la protéine initiatrice.

Ajouter le plasmide à la suspension bactérienne.

Transférez la suspension dans une cuvette réfrigérée.

Amorcez l’électroporation en appliquant une impulsion à haute tension qui perturbe transitoirement la membrane bactérienne, permettant au plasmide d’entrer.

Ajoutez du milieu de récupération et transférez le mélange dans un tube de culture.

Incuber en secouant.

Prenez une plaque de gélose contenant l’antibiotique et mettez la culture en plaque.

La protéine initiatrice bactérienne se lie à l’origine de la réplication, permettant au plasmide de se répliquer et d’exprimer une protéine de résistance aux antibiotiques.

Cela permet aux bactéries avec le plasmide de survivre et de se développer, facilitant l’amplification du plasmide.

Granulez la culture bactérienne par centrifugation à 5 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Mettez le granulé en suspension dans de l’eau distillée réfrigérée et répétez le processus de nettoyage deux fois de plus.

Transférez la suspension de bactéries dans des tubes microfuges et répétez la centrifugation à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir remis le granulé en suspension dans de l’eau glacée, ajoutez environ 3,5 microlitres du mélange de ligature et incubez sur de la glace pendant cinq minutes. Transférez le contenu dans une cuvette d’électroporation réfrigérée à deux millimètres d’espace.

Après l’électroporation, ajoutez le milieu SOC et transférez le contenu dans un tube de culture. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Plaquez les cellules transformées sur des plaques de gélose LB complétées par du chloramphénicol.