Isolement de bactéries à Gram négatif avec des insertions de transposons génomiques

Commencez par décongeler une culture congelée de la population bactérienne à Gram négatif du donneur et du receveur accouplés sur de la glace.

Les cellules réceptrices portent des transposons, de courts segments d’ADN qui comprennent un gène de résistance à l’antibiotique kanamycine. Ces transposons sont intégrés de manière aléatoire dans le génome de l’hôte.

Ajouter la culture dans une plaque de gélose riche en nutriments contenant de la kanamycine, mais sans nutriments spécifiques au donneur.

Ajoutez des billes stériles et tournez doucement la plaque pour répartir uniformément la culture.

Retirez les perles et incubez. Les bactéries réceptrices utilisent des nutriments, mais seules celles avec des transposons intégrés résistent à la kanamycine, ce qui entraîne la formation de colonies.

Les bactéries donneuses et receveuses sans transposons ne se développent pas.

Compter les unités formant des colonies pour estimer le nombre de bactéries réceptrices avec des insertions de transposons uniques.

Ajouter du milieu frais et recueillir la population bactérienne.

Centrifuger pour granuler les bactéries et jeter le surnageant.

Remettre la pastille en suspension dans un milieu contenant un cryoprotecteur pour préserver la viabilité bactérienne.

Décongeler une aliquote de l’accouplement congelé sur de la glace. Ensuite, utilisez des billes de verre stériles pour étaler 150 microlitres de dilution, sur chaque plaque de gélose Luria-Bertani de 30 x 150 millimètres, complétée par de la kanamycine.

Jetez le tube usagé contenant l’excès d’accouplement et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 14 heures. Après l’incubation, comptez les unités formant la colonie sur chaque plaque pour estimer le nombre total de mutants dans la bibliothèque de transposons. Comptez 20 % d’au moins trois plaques pour déterminer l’estimation du nombre de colonies pour l’ensemble du groupe de plaques.

Après avoir calculé le rendement estimé de la colonie, ajoutez trois à cinq millilitres de LB dans chaque assiette et grattez les bactéries à l’aide d’un outil de grattage stérile. Tirez les suspensions bactériennes de toutes les plaques dans des tubes coniques de 50 millilitres et granulez les suspensions en les centrifugeant à 5 000 fois G, pendant sept minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de LB, complétés par 30 % de glycérol.

Ensuite, faites des aliquotes d’un millilitre de la bibliothèque de transposons dans des cryoflacons et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.