Isolement de bactéries à Gram négatif avec des insertions de transposons génomiques

Commencez par décongeler une culture congelée de la population bactérienne à Gram négatif du donneur et du receveur accouplés sur de la glace.

Les cellules réceptrices portent des transposons, de courts segments d’ADN qui comprennent un gène de résistance à l’antibiotique kanamycine. Ces transposons sont intégrés de manière aléatoire dans le génome de l’hôte.

Ajouter la culture dans une plaque de gélose riche en nutriments contenant de la kanamycine, mais sans nutriments spécifiques au donneur.

Ajoutez des billes stériles et tournez doucement la plaque pour répartir uniformément la culture.

Retirez les perles et incubez. Les bactéries réceptrices utilisent des nutriments, mais seules celles avec des transposons intégrés résistent à la kanamycine, ce qui entraîne la formation de colonies.

Les bactéries donneuses et receveuses sans transposons ne se développent pas.

Compter les unités formant des colonies pour estimer le nombre de bactéries réceptrices avec des insertions de transposons uniques.

Ajouter du milieu frais et recueillir la population bactérienne.

Centrifuger pour granuler les bactéries et jeter le surnageant.

Remettre la pastille en suspension dans un milieu contenant un cryoprot