Culture et entretien de bactéries exprimant l’ARNi

Commencez avec une plaque contenant des bactéries exprimant l’ARN interférence ou l’ARNi pré-cultivées.

Ces bactéries portent des plasmides contenant un gène de résistance aux antibiotiques et un insert de gène cible qui produit de l’ARN double brin ou ARNdb pour inhiber l’expression génique spécifique chez l’hôte.

À l’aide d’une épingle stérile, transférez les colonies dans une plaque à puits profond contenant un milieu supplémenté en antibiotiques.

Incuber la plaque en secouant pour une croissance bactérienne uniforme, où les puits profonds assurent l’aération.

L’antibiotique élimine les bactéries qui n’ont pas le plasmide, garantissant ainsi la survie de seules les bactéries porteuses de plasmides.

Centrifugez la plaque pour séparer les bactéries et jetez le surnageant.

Remettez les bactéries en suspension dans une solution saline tamponnée pour les stabiliser.

Distribuez les bactéries remises en suspension dans une plaque multi-puits contenant un milieu riche en nutriments complété à la fois par un antibiotique et un inducteur.

L’antibiotique sélectionne les bactéries porteuses de plasmides, tandis que l’inducteur déclenche l’expression de l’ARNdb.

La plaque ensemencée de bactéries exprimant l’ARNi est prête pour d’autres essais.

Pour tester plusieurs souches bactériennes d’ARNi en parallèle dans un seul puits d’une plaque de puits profonds de 24 puits, inoculez une seule colonie de chaque clone de bactéries contenant de l’ARNi préalablement préparée dans quatre millilitres de LB supplémentés en carbénicilline Récupérez ensuite les bactéries par centrifugation à 2 000 g pendant 5 minutes. Décantez le surnageant en renversant la plaque et en la secouant vigoureusement.

En utilisant 100 microlitres de S Basal, les bactéries ARNi sont remises en suspension. Pipeter les bactéries remises en suspension dans un nombre approprié de puits d’une plaque NGM multi-puits complétée par de l’IPTG et de la carbénicilline et laisser sécher la plaque.