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Une spore bactérienne reste dormante en raison d’une couche de cortex peptidoglycane, un polymère de sucres et d’acides aminés.
Pendant la germination, le cortex se dégrade pour libérer des sucres dans le milieu environnant.
Pour détecter la dégradation du cortex, commencez par le milieu contenant les sucres libérés, collectés à des moments définis pendant la germination des spores.
Utiliser des concentrations croissantes d’étalons de sucre comme référence.
Les étalons et les échantillons ont subi un traitement préalable pour convertir les sucres en une forme réactive.
Incuber avec le réactif d’Ehrlich, un réactif de détection colorimétrique qui réagit avec les sucres et forme un complexe de couleur violette.
Transférez les mélanges sur une plaque multipuits et mesurez l’absorbance des complexes colorés à l’aide d’un lecteur de microplaques.
L’absorbance correspond à l’intensité de la couleur violette, qui est directement proportionnelle à la concentration en sucre.
Une augmentation de l’absorbance sur des échantillons temporels indique une dégradation progressive du cortex.
Générez un graphique à partir des concentrations standard et quantifiez les concentrations de l’échantillon.
Pendant que les échantillons sont sur de la glace, préparez le réactif de couleur. Dissoudre 0,320 gramme de DMAB dans 1,9 millilitre d’acide acétique glacial. Notez que ce réactif est sensible au temps, à la température et à la lumière et ne doit pas être préparé à l’avance.
Une fois que le DMAB s’est complètement dissous, ajoutez 100 microlitres de 10 acides chlorhydriques normaux et vortex l’échantillon. Ajoutez ensuite cinq millilitres d’acide acétique glacial et vortex à nouveau. Pour la réaction colorimétrique, transférez 100 microlitres de chaque cortex refroidi ou échantillon de contrôle dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Ajoutez 700 microlitres de la solution de couleur fraîchement préparée à chaque échantillon. Transférez immédiatement les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez les échantillons pendant exactement 20 minutes. Après l’incubation, transférez 200 microlitres de chaque échantillon dans une plaque transparente à 96 puits.
Les échantillons doivent être de couleur jaune au départ, mais passeront au violet si le sucre réducteur, qui indique la présence de cortex, est présent. Ici, de nombreux échantillons ne montrent pas de couleur violette visible. Cependant, les échantillons de 250, 500 et 5 000 nanomoles semblent visuellement différents de la nanomole de contrôle négatif.
À l’aide d’un lecteur de plaques, déterminez l’absorbance à 585 nanomètres. Lorsqu’il est mesuré dans un diamètre extérieur de 585 nanomètres, le signal généré à partir des échantillons standard correspond le mieux à une régression linéaire.