JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:50 min • September 26th, 2025
Commencez par une culture d’une espèce bactérienne qui code pour des protéines recombinantes marquées avec le peptide de nucléation des vésicules, ou VNp, un peptide court qui favorise la formation des vésicules.
Ajoutez un inducteur à la culture et incuber. L’inducteur déclenche l’expression des protéines.
VNp s’intègre dans la membrane interne et favorise la courbure de la membrane, encapsulant les protéines marquées par VNp dans des vésicules bourgeonnantes.
Transférez le milieu riche en vésicules dans un tube. Centrifugez-le pour séparer le surnageant riche en vésicules.
Ensuite, filtrez le surnageant pour éliminer les contaminants résiduels.
Ensuite, passez le filtrat à travers un autre filtre à membrane pour capturer les vésicules à la surface de la membrane.
Placez la membrane dans un plat et ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate.
Détachez doucement les vésicules et transférez la suspension dans un tube propre.
Soniquer la suspension pour perturber les membranes des vésicules et libérer les protéines.
Centrifuger le lysat pour séparer les fragments de membrane.
Le surnageant résultant contient des protéines recombinantes purifiées, prêtes à être analysées.
Induire l’expression de la protéine recombinante à partir du promoteur T7 en ajoutant IPTG à une concentration finale allant jusqu’à 20 microgrammes par millilitre, soit 84 micromolaires. Après avoir laissé suffisamment de temps pour l’induction, granulez les cellules par centrifugation à 3000 g et 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Passez le surnageant à travers un filtre PES de 0,45 micron stérile et sans détergent pour stériliser la vésicule contenant un milieu de stockage à long terme.
Pour concentrer les vésicules dans un volume plus petit, faites passer le milieu contenant la vésicule stérile à travers un filtre MCE de 0,1 micron stérile et sans détergent. Ensuite, lavez doucement la membrane avec 0,5 à 1 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate stérile, ou PBS, et utilisez un grattoir cellulaire ou un épandeur de plastique pour retirer soigneusement les vésicules de la membrane. Transférez le concentré de vésicule dans un tube de microcentrifugation frais à l’aide d’une pipette.
Les vésicules purifiées peuvent être stockées à 4 degrés Celsius. Sonicer les vésicules contenant la protéine dans le milieu stérile en utilisant un calendrier approprié pour perturber les membranes lipidiques vésiculaires et libérer la protéine. Centrifugez la suspension soniquée à 39 000 g et 4 degrés Celsius pendant 20 minutes pour éliminer les débris vésiculaires.