F Transfert de plasmide et double sélection d’antibiotiques chez E. coli
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:30 min • September 26th, 2025
Commençons par des cellules E. coli de donneur portant un plasmide F dans lequel un gène de transfert est remplacé par un gène de résistance aux antibiotiques.
Ces cellules contiennent également un plasmide de secours qui code pour le gène de transfert manquant.
Prenez des volumes égaux de cellules E . coli receveuses avec un gène de résistance aux antibiotiques différent dans leur ADN.
Mélangez les deux cultures dans un milieu nutritif sans antibiotiques et incubez sans agiter.
Le plasmide de secours de la bactérie donneuse exprime le gène de transfert, permettant à la cellule donneuse de construire un F-pilus.
Le pilus forme un pont entre deux cellules, permettant le transfert unidirectionnel de plasmides du donneur au receveur, formant des transconjugants.
Vortex le mélange pour perturber les couples d’accouplement et placez-le sur de la glace pour empêcher tout nouvel accouplement.
Repérez la culture sur des plaques de gélose contenant des antibiotiques transconjugaisables sélectionnables et incubez.
Les transconjugants, porteurs des deux gènes de résistance aux antibiotiques, survivent et forment des colonies en présence des deux antibiotiques, confirmant ainsi le transfert réussi du plasmide F.
En double, aliquote 100 microlitres de cellules donneuses et 100 microlitres de cellules receveuses à 800 microlitres de milieu LB stérile pour un volume total d’un millilitre. Laissez les cellules s’accoupler à 37 degrés Celsius pendant une heure sans secouer. Au bout d’une heure, faites un vortex sur les cellules pendant 30 secondes pour perturber les couples d’accouplement.
Ensuite, placez les cellules sur de la glace pendant 10 minutes pour éviter tout nouvel accouplement.
Sélectionnez les cellules transconjuguées MC4100 qui hébergent l’inactivation du chloramphénicol pOX38-Tc en repérant dix aliquotes d’un microlitre de chaque dilution sur chaque moitié des plaques de gélose contenant de la streptomycine et du chloramphénicol. Répétez l’opération pour les deux mélanges en double. Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Aperçu
Cette étude décrit une méthode de transfert de plasmides entre cellules d’E. coli à l’aide d’un pilus F. Le processus consiste à mélanger des cellules donneuses et des cellules receveuses, permettant ainsi la formation de transconjugants porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Génie génétique
- Résistance aux antibiotiques
Contexte
- Le transfert de plasmide est un mécanisme clé en génétique bactérienne.
- Les pili F facilitent le processus de conjugaison entre les bactéries.
- La compréhension du transfert de plasmide peut aider à lutter contre la résistance aux antibiotiques.
- Cette méthode utilise des gènes spécifiques de résistance aux antibiotiques pour la sélection.
Objectif de l'étude
- Démontrer le transfert de plasmides entre souches d’E. coli.
- Établir un protocole permettant de sélectionner les transconjugants réussis.
- Explorer les implications du transfert de plasmides dans la résistance aux antibiotiques.
Méthodes utilisées
- Préparation de cellules donneuses d’E. coli contenant un plasmide F.
- Mélange des cellules donneuses et receveuses d’E. coli dans un milieu nutritif.
- Incubation permettant le transfert du plasmide via le pilus F.
- Sélection des transconjugants sur des géloses contenant un antibiotique.
Résultats principaux
- Formation réussie de transconjugants portant les deux gènes de résistance aux antibiotiques.
- La croissance des colonies sur milieu sélectif a confirmé le transfert du plasmide.
- Le protocole a démontré une reproductibilité entre les expériences réalisées en double.
- Les résultats indiquent une utilisation efficace du pilus F pour l'échange génétique.
Conclusions
- La méthode démontre efficacement le transfert de plasmide chez E. coli.
- Les résultats contribuent à la compréhension des mécanismes d'échange génétique.
- Des applications potentielles dans l'étude de la dynamique de la résistance aux antibiotiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet l'interrogation mécanistique des mécanismes de transfert de plasmide dans les systèmes bactériens, soutenant la validation de cibles en découverte d'agents antimicrobiens. En quantifiant l'efficacité du transfert conjugatif dans des conditions contrôlées, il fournit un test reproductible pour réduire les risques liés aux candidats antimicrobiens en phase précoce. La stratégie de sélection double antibiotique offre une mesure évolutive pour évaluer les inhibiteurs d'échange génétique dans les filières précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Étudie le transfert médié par le pilus F comme cible pour une intervention antimicrobienne.
- Valeur opérationnelle : Permet de tester l'hypothèse d'inhibiteurs des gènes de transfert à l'aide de la formation mesurable de transconjugants.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit un dosage quantitatif de l'efficacité de transfert des plasmides dans des conditions standardisées.
- Valeur opérationnelle : Permet le criblage à haut débit de composés perturbant la conjugaison.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Modélise la dynamique du transfert horizontal de gènes, pertinente pour la propagation de la résistance chez les souches pathogènes.
- Valeur opérationnelle : Guide l'optimisation des composés en associant l'activité du composé à une réduction du rendement en transconjugants.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où des composés candidats antimycobactériens ou anti-infectieux sont évalués pour des mécanismes allant au-delà de l'inhibition de la croissance.
- Biologie du découverte : Mesure l'inhibition du transfert de plasmide conjugatif comme indicateur fonctionnel de l'engagement du gène cible.
- Écranage : Fournit des données reproductibles et quantitatives sur les unités formant des colonies pour la validation des composés actifs.
- Analytique : Permet le calcul des rapports de fréquence de transfert afin de comparer l'efficacité des composés dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'intègre à l'évaluation préclinique du potentiel de réduction de la résistance dans des modèles bactériens pertinents.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme modulaire permettant d'évaluer les inhibiteurs de conjugaison dans divers contextes génétiques de souches.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Désamorçage mécanistique des candidats antimycobactériens en évaluant leur impact sur le transfert horizontal de gènes.
- Valeur opérationnelle : Un protocole standardisé avec sélection double par antibiotiques assure la robustesse du test et sa reproductibilité interlaboratoire.
- Valeur stratégique : Soutient les décisions d'orientation (go/no-go) en identifiant précocement les composés qui suppriment la dissémination de la résistance.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des squelettes présentant une activité double : inhibition de la croissance et blocage du transfert.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de culture bactérienne et en protocoles de sélection aux antibiotiques.
- Dépend de l'accès à des souches donneuses et receveuses isogéniques munies de marqueurs de résistance définis.
- Implique des conditions d'incubation contrôlées (37 °C, sans agitation) afin d'assurer une formation constante des pili.
- Exige des étapes standardisées de vortexage et de traitement sur glace pour synchroniser l'interruption de l'accouplement entre les réplicats.
- Limité aux systèmes de plasmides compatibles avec le transfert médié par le pilus F ; n'est pas applicable à tous les mécanismes de conjugaison.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026