Quantification de l’inactivation bactérienne induite par la lumière par génération d’espèces réactives de l’oxygène

Commencez avec un mélange réactionnel tamponné contenant de la L-méthionine, un donneur d’électrons, du tétrazolium nitro-bleu ou NBT, un indicateur redox et du mononucléotide de flavine ou FMN, un photosensibilisant.

Ajoutez ce mélange dans un tube contenant la pastille bactérienne et le vortex.

Transférez la solution dans un tube de verre.

Maintenant, irradiez le mélange avec de la lumière violette pour activer FMN, qui accepte un électron de la L-méthionine, formant un intermédiaire réactif.

Cet intermédiaire transfère l’électron à l’oxygène moléculaire dissous, générant des espèces réactives de l’oxygène ou ROS près de la surface bactérienne.

Les ROS qui en résultent endommagent les composants cellulaires et réduisent la viabilité bactérienne.

Le ROS réduit également le NBT en formazan, un produit de couleur bleue qui se dépose près de la surface bactérienne.

Transférez le mélange dans un tube, centrifugez-le et jetez le surnageant.

Remettre la pastille en suspension dans un solvant organique pour solubiliser le formazan.

Enfin, mesurez l’absorbance pour déterminer l’inactivation bactérienne induite par la lumière par la génération de ROS.

Préparez les échantillons de Staphylococcus aureus comme décrit précédemment pour obtenir une pastille cellulaire. À 75 millilitres de tampon phosphate, ajoutez 0,1093 gramme de L-méthionine, 0,1 gramme de NBT et 25 millilitres de solution FMN.

Ajoutez un millilitre de chaque solution réactive avec des concentrations variables de FMN aux pastilles de cellule et au vortex. Irradiez les solutions sous une lumière violette à 10 watts par mètre carré pendant 10 minutes. Centrifugez le mélange à 14 000 G pendant 10 minutes et décantez le surnageant.

Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de diméthylsulfoxyde pour extraire le NBT réduit. Enregistrez l’absorbance à 560 nanomètres.