Name: Développement dun marqueur sélectionnable négatif pour les Entamoeba histolytica /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Découvrez le système de sélection négative FCU1 pour Entamoeba histolytica utilisant le prodrug 5-fluorocytosine. Cette méthode permet l'élimination sélective des cellules transfectées et facilite la manipulation génétique de ce parasite.

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Nous tenons à remercier le Dr Philippe Erbs pour nous avoir fourni la séquence du gène FCU1. Ce travail a été soutenu par le NIH subventions AI 26649.

1. Système FCU sélection négative dans Entamoeba histolytica <ol><li> La ligne de la lutte antivectorielle (HM1 / pKT3M) et la ligne expérimentale (HM1/pKT3M-FCU1) ont été générés par 1,2 les techniques décrites précédemment. Graine les lignes à l'étude à partir des tubes d'actions dans T-25 flacons et conserver la sélection par l'ajout des antibiotiques appropriés (12 pg / ml de G418) dans TYI-S-33 3 moyen. Les flacons doivent être 70-80% confluentes après 16-18 heures de croissance à 37 ° C. </li><li> Préparer une solution stock de frais de 50mm de la 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) dans chaude TYI-S-33 à moyen terme. Vortex rigoureuse pendant plusieurs minutes à se dissoudre complètement la 5-FC. Filtre-stériliser la solution stock en le passant à travers un filtre de 0,22 um. </li><li> Trophozoïtes récolte en plaçant les flacons sur la glace pendant 3-5 minutes et recueillir les cellules par centrifugation à 200xg pendant 5 minutes à température ambiante. Reprendre le culot dans TYI milieu frais et compter les cellules. </li><li> Conception d'une expérience typique utilise 0,5 x 10 4 cellules par puits d'une plaque de 48 puits dans un volume final de 1 ml, et répète trois exemplaires pour chaque condition d'essai. En outre, pour faciliter les mesures fluorescente, une plaque séparée est utilisée pour chaque souche par point dans le temps. </li><li> Graine de 0,5 x 10 4 cellules par puits pour chaque test de concentration de 5-FC, en trois exemplaires. Maintenir la pression de sélection antibiotique dans le milieu TYI. Maintenant, ajoutez la quantité requise de 5-FC solution stock et des trophozoïtes à chaque puits. </li><li> Incuber les plaques dans un sac anaérobie à 37 ° C. </li></ol> 2. Détermination de l'efficacité de sélection <ol><li> Préparer 2 mg / ml solution stock de Cell Tracker CMFDA vert (Invitrogen) dans le DMSO. Pour rendre la solution de travail diluer le stock de 1000 fois dans un milieu sans sérum TYI. </li><li> Retirez le support complètement de plaques de culture trophozoïte et la remplacer par 150 ul sans sérum contenant CMFDA TYI. Continuer d'incubation à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Retirer la solution de colorant à partir de puits et de lire la plaque dans le spectrofluorimètre microplaques Spectramax M2. La longueur d'onde d'excitation doit être réglé à 492 nm et l'émission de fluorescence lue à 517 nm. </li><li> Comparez les valeurs de fluorescence pour les cellules de contrôle par rapport au test de transfectants. </li><li> Continuer la lecture des plaques à chaque intervalle de temps. Utilisez positifs appropriés (TYI seulement) et négatifs (25 ug / ml d'hygromycine) puits de contrôle dans chaque assiette. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Le E. transfectants histolytica a montré une expression robuste de codon FCU1 recombinante optimisée (figure 1). Lorsque ce protocole est suivi correctement il en résulte l'élimination sélective des E. cellules exprimant FCU1 histolytica en présence de 0,5 mM de 5-fluorocytosine. Cellules de contrôle, en revanche continuer à croître normalement à un maximum de 5 mM de concentration de 5-FC et atteindre la confluence entre 72 et 96 heures (figure 2-a). Les cellules porteuses FCU1 à 48 heures sont complètement lysées lorsque le puits traités sont considérés sous un microscope. Ces montrent également une diminution de fluorescence lorsqu'elles sont colorées avec le colorant vital CMFDA, qui est utilisé dans les études quantitatives impliquant grand nombre d'échantillons (figure 2-b). Le système FCU1/5-FC est un outil de sélection efficace et puissant négatifs pour E. histolytica trophozoïtes. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Génération de E. histolytica HM1 transfectants exprimant marqueur de sélection négative (A) FCU1 protéine recombinante a été détecté sur un western blot à l'aide d'anticorps anti-c Myc (panneau supérieur). Comme prévu, une bande 42kDa a pu être détecté (indiqué par une flèche) dans le lysat total de la transfectants FCU, mais pas dans le vecteur seul transfectants contrôle. Le panneau du bas montre la même blot sondé avec l'anticorps anti-actine comme contrôle du chargement. (B) Résultats de la PCR en temps réel quantitative montrant l'expression des ARNm spécifiques FCU1 normalisée à lgl4 contrôle. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Sensibilité aux médicaments in vitro de E. transfectants exprimant histolytica marqueur de sélection négative Les courbes de survie des transfectants de contrôle (a) et (b) des transfectants exprimant FCU1 cultivées dans 48 puits assiette. Les cellules ont été cultivées en présence de concentrations croissantes de la prodrogue-5-fluorocytosine, la survie cellulaire a été quantifiée par une coloration CMFDA à chaque intervalle de temps que notée sur le X-axe. L'axe Y représente les unités de fluorescence et est le reflet direct de la population de cellules survivantes. S'il vous plaît noter que les transfectants exprimant FCU1 a montré une sensibilité significative à la concentration 0,5 mM prodrogue par rapport au témoin. Pas de cellules ont été observées au point dans le temps 120h dans ces puits comme comcomparé à la croissance confluente vu dans le puits de contrôle correspondants sous le microscope (données non présentées). Hygro représente 25μg / ml d'hygromycine utilisé comme contrôle négatif.

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
<li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+C+%22Anaerobic+parasitic+protozoa+%3A+genomics+and+molecular+biology%22">Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology</a>. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).</li>
<li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li>
<li>Solis, C. F., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li>
<li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li>
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<li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li>
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<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

La production de cette vidéo a été parrainé par Sigma Aldrich, Inc, qui produit certains des réactifs utilisés dans cet article.

Bien qu&#39;il y ait eu des progrès substantiels dans Entamoeba outils de biologie moléculaire il n&#39;existe pas de méthodes actuellement disponibles pour supprimer ou perturber les gènes 4. Knockdown de l&#39;expression génique spécifique a été réalisé par l&#39;utilisation d&#39;ARN en épingle à cheveux 5, 6 petits ARN interférents et exprimées par la bactérie ARNdb 7. Cependant, ces méthodes tout en étant efficace pour les gènes cibles respectifs, ont plusieurs limites dont l&#39;utilisation des produits chimiques coûteux, la sélection continue contre les antibiotiques et la nécessité pour la validation constante due à l&#39;incidence élevée de réversion survenant au cours du temps (Alicia Linford, communication personnelle) 8. Toute plasmide peut se répliquer dans les Entamoeba car il n&#39;est apparemment pas une exigence stricte pour la séquence origines de réplication de l&#39;ADN 9, et donc une fois transfectées, il est généralement difficile à guérir un plasmide. Ceci limite l&#39;utilisation possible des plasmides intacts dans des expériences de recombinaison et knockout du gène. Marqueurs de sélection négative sont des éléments clés de ciblage génique méthodes, car ils peuvent être utilisés pour éliminer les sous-populations recombinantes. Nous avons exprimé avec succès un codon optimisé FCU1 gène dans E. histolytica et testé son potentiel en tant que marqueur sélectionnable négatif. Ce gène de fusion a été utilisé pour la thérapie génique suicide de cellules tumorales humaines et métabolise le promédicament 5-FC en produits toxiques aval résultant de l&#39;inhibition de la synthèse d&#39;ARN et l&#39;ADN 10. FCU1 a été récemment utilisé comme un marqueur sélectionnable négatif au Plasmodium, un autre parasite protozoaire. Plasmodium berghei cellules exprimant FCU1 ont été trouvés pour être près de 1000 fois plus sensible à la prodrogue in vitro et in vivo avec un traitement de 5-FC a tué plus de 99,9% du infectant des parasites recombinants dans le modèle de souris au stade érythrocytaire du paludisme 11. E. cellules exprimant FCU1 histolytica a montré qu&#39;une sensibilité de 30 fois plus élevé au promédicament 5-FC par opposition à la sensibilité observée dans P. berghei. Les raisons possibles pour cela pourrait être important bassin de nucléotides disponibles dans le milieu de croissance en compétition avec les métabolites toxiques. Dans les deux P. berghei et P. falciparum le marqueur FCU1 a été utilisé dans disruption génique ciblée. Des études 11,12. Notre objectif est de manipuler le génome Entamoeba utilisant la recombinaison homologue. La validation du système de sélection négative FCU1/5-FC est une étape importante vers cet objectif.

<table><tbody><tr><td>Milieu TYI-S-33</td><td>ATCC</td><td></td><td>Référence incluse dans le texte</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-Fluorocytosine&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Traceur cellulaire vert CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques Spectra Max M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un marqueur sélectionnable négatif pour les entamoeba histolytica</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica est l&#39;agent causal de l&#39;amibiase et infecte jusqu&#39;à 10% de la population mondiale. Les techniques moléculaires qui ont permis le haut et le bas-régulation de l&#39;expression génique reposent sur la transfection de plasmides maintenu de manière stable. Alors que ceux-ci ont amélioré notre compréhension des facteurs de virulence Entamoeba, la capacité d&#39;intégrer l&#39;ADN exogène dans le génome, ce qui permettrait inverse expériences génétique, serait un avantage significatif dans l&#39;étude de ce parasite. Les défis présentés par cet organisme comprennent l&#39;incapacité de choisir pour les événements de recombinaison homologue et de la difficulté à guérir épisomale ADN plasmidique de trophozoïtes transfectées. Les résultats plus tard dans un bruit de fond élevé d&#39;ADN exogène, un problème majeur dans l&#39;identification des trophozoites dans lequel une bonne foi évènement intégration génomique s&#39;est produite. Nous rapportons le développement d&#39;un système de sélection négative basée sur l&#39;expression transgénique d&#39;une cytosine désaminase de la levure et l&#39;uracile phosphoribosyl transférase chimère (FCU1) et la sélection avec prodrogue 5-fluorocytosine (5-FC). L&#39;enzyme convertit FCU1 non toxique 5-FC en 5-fluorouracile toxiques et 5-fluoro-5&#39;-monophosphate. E. histolytica lignes exprimant FCU1 ont été trouvés à 30 fois plus sensible à la prodrogue par rapport à la souche témoin.

Nous rapportons le développement d&#39;un système de sélection négative dans<em&gt; E. histolytica</em&gt; Basé sur l&#39;expression transgénique d&#39;une protéine chimérique (FCU1) et la sélection avec la prodrogue 5-fluorocytosine. La protéine FCU1 est une fusion de la cytosine désaminase levure et uracile phosphoribosyltransférase. Expression de FCU1 entraîné une augmentation<em&gt; E. histolytica</emSensibilité&gt; vers la 5-fluorocytosine.

Développement d&#39;un marqueur sélectionnable négatif pour les Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica est l'agent pathogène responsable de l'amibiase et infecte jusqu'à 10 % de la population mondiale. Les techniques moléculaires ayant permis le...

L'objectif général de cette expérience est de valider l'utilisation du système FCU1 à cinq FC comme méthode de sélection négative chez Entamoeba histolytica. Dans des plaques de 48 puits, ensemencer E. histolytica, transfecter des lignées exprimant soit le gène FCU1 soit un contrôle vectoriel approprié, puis traiter les cellules avec le pro-médicament 5-FC. Dans les cellules exprimant des niveaux élevés de FCU1, le 5-FC sera converti en quantités efficaces de produits finaux toxiques. La population cellulaire survivante est colorée avec le C-M-F-D-A afin de démontrer l'élimination sélective des cellules exprimant FCU1 en présence de 5-FC et de comparer quantitativement l'efficacité de la sélection négative. Ce système de sélection négative permettra, pour la première fois, d'éliminer des plasmides épisomaux chez Entamoeba histolytica transfecté.Étant donné la difficulté liée à la présence d'anticorps face à la manipulation génétique classique, cette méthode pourrait nous permettre d'interrompre et de supprimer des gènes, puis de tester des facteurs VIH ciblés dans notre programme de découverte de médicaments. Les trophozoïtes peuvent varier selon la vigueur avec laquelle les souches se développent en culture. Une erreur au départ peut produire des artéfacts, et par conséquent une étape critique précoce consiste à contrôler la qualité de la culture initiale.Ensemencez les lignées inba hisa étudiées à partir de tubes de stock dans des flacons T25 et maintenez la sélection en ajoutant l'antibiotique approprié dans le milieu TYIS 33. Incubez les flacons à 37 degrés Celsius pendant 16 heures afin que les cultures atteignent environ 80 % de confluence. Pour cette procédure, préparez toujours un stock frais de 50 millimolaire de fluorure de cinq ou FC dans du TYIS 33 tiède.Vortexer vigoureusement le milieu pendant plusieurs minutes pour dissoudre complètement les cinq FC, puis filtrer et stériliser la solution mère à l’aide d’un filtre de 0,22 micron afin de récolter les trophozoïtes. Placer les flacons sur de la glace pendant trois à cinq minutes et recueillir les cellules par centrifugation à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Résuspender le culot dans un milieu TYI frais et dénombrer les cellules afin de faciliter les mesures fluorescentes ultérieures.Réalisez les expériences en triplicat et utilisez une plaque séparée de 48 puits pour chaque souche par point temporel d'ensemencement, avec 0,5 fois 10 à la puissance quatre cellules par puits dans un volume de 0,5 millilitre pour chaque test. Concentration de 5 FC, et maintenez la pression de sélection antibiotique dans le milieu TYI. Ajoutez maintenant la quantité requise de solution mère de 5 FC, suivie de milieu TYI, pour obtenir un volume final d'un millilitre dans chaque puits, puis incubez les plaques dans un sachet anaérobie à 37 degrés Celsius.Préparez une solution mère à deux milligrammes par millilitre de traceur cellulaire vert C-M-F-D-A dans le DMSO. Ensuite, pour préparer la solution de travail, diluez la solution mère 1 000 fois dans du milieu TYI sans sérum aux points temporels expérimentaux spécifiés. Retirez complètement le milieu des plaques de culture Tropho Xite et remplacez-le par 150 microlitres de milieu TYI sans sérum contenant le C-M-F-D-A.Poursuivre l'incubation à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis aspirer la solution DI des puits. Enfin, lire la plaque dans le spectrofluorimètre microplaque Spectra Max M2 en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 492 nanomètres et une émission fluorescente de 517 nanomètres. Comparer les valeurs de fluorescence des cellules témoins par rapport aux cellules transfectées test.Continuez à lire les plaques à chaque intervalle de temps. Utilisez toujours des puits témoins positifs et négatifs appropriés sur chaque plaque. Les analyses Western BLO démontrent la production réussie du transfect lyA exprimant FCU1, le chimère de la cytosine désaminase de levure et de la phosphoribosyltransférase d'uracile.Ces résultats se retrouvent également dans les mesures de PCR quantitative. En présence de cinq fluorures, les cellules contrôles se développent normalement jusqu'à une concentration de cinq millimolaire et atteignent la confluence entre 72 et 96 heures. En revanche, les cellules d'Entamoeba histolytica exprimant FCU1 sont éliminées sélectivement en présence de 0,5 millimolaire du prodrogue, comme observé en microscopie champ clair.La réponse sélective des cellules d'E. histolytica exprimant FCU au traitement par les cinq médicaments FC Pro est visible par la claircissement des cellules. Dans ce cas, les cellules sont cultivées 72 heures après la transfection. Lors de la réalisation de cette expérience, il est important de se rappeler de surveiller la croissance à chaque point temporel.Cette méthode peut être utilisée en mutagenèse « hit and run », que nous appliquerons pour répondre à des questions importantes concernant la virulence d'Inba Hisa.

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