Name: Enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Apprenez à enregistrer les potentiels post-synaptiques dans les muscles DLM et TTM de Drosophila melanogaster pour étudier la transmission synaptique dans la voie des fibres Géant. Cette méthode électrophysiologique permet d'évaluer les propriétés fonctionnelles des circuits neuronaux.

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1. Équipement et matériel <ol><li> Ces expériences utilisent une configuration standard électrophysiologie composé d'un stimulateur, une unité d'isolement de relance, deux amplificateurs microélectrode, un système d'acquisition de données et un ordinateur avec un logiciel de collecte. L'équipement supplémentaire comprend une cage de Faraday, un stéréomicroscope sur une perche, une table anti-vibrations, une source de lumière, et une plateforme d'enregistrement. </li><li> Cinq micromanipulateurs sont utilisés. Deux micromanipulateurs exigent des contrôles très bien pour le positionnement des électrodes d'enregistrement, tandis que les trois autres micromanipulateurs seulement exigent des contrôles brute à la position des deux électrodes de stimulation et l'électrode de masse. Le micromanipulateur pour l'électrode d'enregistrement DLM est placé à la toute fin de la préparation (à gauche de l'expérimentateur) et le micromanipulateur pour l'électrode d'enregistrement TTM est placée entre l'expérimentateur et le côté de la préparation (légèrement à gauche de l'expérimentateur). Les deux micromanipulateurs qui contiendra les électrodes de simulation sont placés à la tête de la préparation (à droite de l'expérimentateur). Le micromanipulateur pour l'électrode de masse est placé à l'extrémité de la préparation </li><li> Tirez microélectrodes d'enregistrement en verre avec des résistances de 40-60 MQ et stocker à plat dans un plat soutenu par la cire. Pour la stimulation, deux électrodes de tungstène par électrolyse (NaOH) aiguisés sont utilisés. Un fil de tungstène, ou une troisième électrode électrolyse fabriquée est utilisée comme un motif. Les électrodes de stimulation et la terre sont préparés et attachés à la micromanipulateurs avant le début de la session expérimentale et ne doit pas être remplacé pour la durée de la session. </li></ol> 2. Préparation de la D. melanogaster <ol><li> Une fois que votre équipement est mis en place, il est temps de préparer les mouches. Anesthésier les mouches par le refroidissement de la glace sur eux ou en utilisant du CO 2. Si le CO 2 est utilisé, puis laisser suffisamment de temps (environ 20mn) pour les effets des gaz à s'user avant le début de l'expérience. </li><li> Utilisez une pince pour transférer les mouches doucement par leurs jambes pour un plat contenant une plate-forme de cire molle incliné à un angle de 45 ° environ. Les quatre prochaines étapes sont effectuées sous un microscope à dissection loin (mais proche de) l'équipement d'enregistrement. </li><li> La prochaine étape est de sécuriser la volée dans la cire. Orienter le côté voler ventrale vers le bas, avec ses antérieure orientée vers le haut sur la pente. En utilisant une paire de pinces fines, étendre les jambes vers l'extérieur, par paires, et les pousser dans la cire. </li><li> Familiarisez-vous avec l'emplacement des muscles pour être enregistrées à partir de: le muscle dorsal longitudinal ou DLM, et le muscle tergotrochanteral ou TTM. Les sites de fixation de l'subcuticulaires DLMS correspondre à la région située entre la ligne médiane thoracique et de la dorsale antérieure poils (ou soies). Les sites de fixation sont situés dorsalement TTM de l'antérieur et postérieur supra-alaires poils. Faire en sorte que les ailes ne seront pas gêner l'accès aux fibres DLM ou TTM, maintenez les ailes vers l'extérieur et «coller» à la cire. </li><li> Utiliser une belle paire de pinces, tirez la trompe vers l'extérieur avec soin, et fixez-le en l'immergeant dans la cire. Ceci est une étape critique qui nécessite une certaine pratique depuis la trompe est souple et se détache facilement du reste de la tête. Si cela arrive, jetez la volée et recommencer. Faute d'obtenir la tête de cette manière conduit à des problèmes lors de l'insertion des électrodes de stimulation par les yeux. </li></ol> 3. Placement des électrodes <ol><li> Une fois que la mouche est ancré à la cire, le transfert du plat avec la mouche fixé sous le stéréomicroscope qui est situé à l'intérieur de la cage de Faraday. Orienter la volée sur le côté avec la tête de la mouche à la droite de l'expérimentateur. </li><li> L'étape suivante consiste à insérer les électrodes. Électrodes de masse et la stimulation peut être inséré sans regarder dans le microscope. De bons enregistrements comptent sur empalement précis, c'est donc une bonne idée de pratiquer la manipulation des micromanipulateurs. Apportez les électrodes à proximité des sites d'insertion avec l'aide de micromanipulateurs afin de faciliter leur placement judicieux et des enregistrements ultérieurs. </li><li> L'électrode de masse inférieure à l'extrémité postérieure de l'abdomen en utilisant les roues de réglage sur le micromanipulateur. Pour placer les électrodes de tungstène affûté stimulant dans le cerveau, l'utilisation du micromanipulateur pour positionner la pointe de l'une des électrodes de sorte qu'il touche juste l'un des yeux de mouche. Faites de même avec l'autre afin que les deux électrodes sont juste toucher l'extérieur de chaque oeil. Ensuite, poussez les électrodes, à leur tour, à travers chaque œil de sorte que le bout des électrodes atteindre le cerveau située à l'arrière de la capsule céphalique (environ 2-3mm). </li><li> Électrodes placées correctement pour activer le système de fibre géante. Pour vérifier que les électrodes de stimulation sont placés correctement, appliquer une courte (0,03 ms) Relance de 30-60 V sur les électrodes de stimulation, et regarder pour le mouvement des ailes et des tics du muscle vol / jambe » </li><li> L'étape suivante consiste à remblayer les microélectrodes en verre avec 3M KCl en utilisant un Hamilton ou à la chaleur tirée seringue en plastique et les placer dans le micromanipulateurs beaux-contrôle. Microélectrodes insérées correctement peuvent être utilisés pour plusieurs séries d'expériences. </li><li> L'électrode premier enregistrement sera inséré dans une fibre DLM. Il ya deux DLMS bilatéralement symétriques, chacune est composée de six fibres musculaires individuelles. Les enregistrements peuvent être fait à partir de n'importe laquelle des six fibres; cependant, les plus couramment utilisés sont les fibres de DLM 45a et 45b en raison de leur bonne accessibilité grâce à la face dorsale de la cuticule thoracique, et le fait que les deux fibres sont innervées par les motoneurones mêmes . </li><li> Utilisation du micromanipulateur sur le côté le plus éloigné de vous, insérez une électrode d'enregistrement en fibre de DLM 45a ou b. La pente de la plate-forme permet à l'électrode DLM pour entrer dans la cuticule dorsale à un angle de ~ 60 à 90 °, ce qui favorise la pénétration. Utilisez le logiciel en mode oscilloscope et de regarder l'écran d'ordinateur tout en insérant des électrodes d'enregistrement dans le thorax. Lorsque l'électrode est entré dans un muscle de la ligne de base passera à près de zéro ou une valeur négative. Test avec un stimulus unique de voir si vous pouvez observer la réponse musculaire. </li><li> Insérer l'électrode d'enregistrement autre dans le TTM proche de chez vous. Cette électrode est insérée latéralement, en face de vous, à cause de l'emplacement du site d'attachement du muscle. Encore une fois d'observer le moniteur tout en faisant cela et de tester avec un stimulus unique fois la trace indique l'électrode est dans le muscle. </li></ol> 4. Stimulation et d'enregistrement <ol><li> Vous êtes maintenant prêt à commencer la stimulation du cerveau et de l'enregistrement des réponses de la jambe et les muscles de vol. Appliquer une courte (0,03 ms) relance à travers les électrodes de stimulation à partir de 30 V et 60 V augmente jusqu'à ce que vous observez une réaction (à savoir une contraction musculaire, et une dépolarisation des cellules musculaires comme observé sur l'écran d'ordinateur). Pour le reste de l'expérience, régler la tension V 50-10 dessus du seuil de réponse. </li><li> Pour mesurer la latence de réponse, donnez au moins 5 des stimuli simples avec une durée de 5 secondes de repos entre chaque stimulus. </li><li> Déterminer la "fréquence de suivre" en fournissant des trains de stimuli à des rythmes différents. Typiquement 10 trains de 10 stimuli sont donnés à 100Hz (10ms entre chaque stimulus), 200Hz (5ms entre chaque stimulus) et 300Hz (3ms entre chaque stimulus). Autoriser une période de repos de 2 secondes entre chaque train de stimuli. </li></ol> 5. Résultats: latences de réponse et fréquence de la suite dans la voie des fibres géantes <ol><li> La latence de réponse est le temps entre la stimulation du cerveau et de la dépolarisation du muscle. Ce chiffre se compare les latences de réponse pour DLM et TTM à un stimulus unique. Latences entre 0,7 et 1,2 ms pour la voie de GF-TTM et entre 1,3 et 1,7 ms pour la voie de GF-DLM indiquent une préparation saine et technique d'enregistrement approprié. Les latences peuvent varier avec le génotype, le patrimoine génétique, de la température et l'âge. La figure 1 (A et B). Représentant des traces montrant les réponses enregistrées à partir du TTMS et DLMS suite à un stimulus unique appliquée au cerveau. </li><li> Comme le montre ici, les enregistrements de la TTM montrent plus de variabilité en termes d'amplitude et la forme des potentiels postsynaptiques (PSP) comparativement à ceux des fibres DLM grande; cette variabilité accrue est due à la faible taille des fibres musculaires TTM. Cette variabilité, cependant, n'affecte pas les valeurs de latence de réponse pour le géant de fibre-to-TTM voie. «Latence de réponse» La figure 1 (C et D). En outre des traces de 4 mouches individuels à la fois pour la TTM et DLM. Notez la variabilité présentent des traces en forme de TTM PSP mais la latence de réponse n'est pas affectée. Pour DLM il ya moins de variabilité dans la forme PSP. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Figure 1 A-D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1-D"> </li><li> Comparez la «fréquence de suivre" à 100 Hz, 200 Hz, 300 Hz et en calculant la proportion de réponses réussies (sur 10) pour les deux voies de DLM et TTM à chaque fréquence de stimulation. A 100 Hz, les deux TTM et DLM suivre les stimuli 01h01. Au fréquences de stimulation supérieures à 100 Hz, les réponses DLM commencer à montrer des défaillances en raison de la synapse chimique intermédiaire entre deux interneurones n'a pas suffisamment de temps pour récupérer entre les stimuli. Les réponses TTM, cependant, restent 1:1 avec des stimuli au-delà même 300Hz. Figure 2. Représentant des traces montrant la "fréquence de la suite" des enregistrements. A 100Hz, deux TTMS et DLMS répondre à toutes les 10 stimuli (à gauche). A 200 Hz, les réponses commencent à échouer DLM (astérisque). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Sauvage de type court temps de latence des réponses (électrodes stimulés sont placés dans les yeux, sans passer par les récepteurs sensoriels et de déclencher le circuit GF directement) dépendent du génotype, le patrimoine génétique, la température et l'âge, et se situent entre 0,7 et 1,2 ms pour la voie de GF-TTM et 1,3 ms pour and1.7 la voie GF-DLM (Tanouye et Wyman, 1980; Thomas et Wyman, 1984; Engel et Wu, 1992; Allen et Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, non publié.) . Cette latence très court TTM est dû à la robustesse des synapses GF-TTMn électrochimique de la voie monosynaptique et la latence plus DLM se produit parce que la nature disynaptique de la voie ainsi que la présence d'une synapse chimique (PSI-DLMn). Intermédiaire et à long temps de latence des réponses (&gt; 3 ms) résultent de l'activation des afférences GF et sont réalisés soit en utilisant une stimulation de faible intensité ou de fournir un visuel («light-off») du signal. À la fois 100Hz TTM et DLM devrait suivre les stimuli 01h01. Au-dessus de 100Hz réponses DLM va commencer à montrer des défaillances que la synapse chimique entre l'ISP et le DLMns n'a pas suffisamment de temps pour récupérer entre les stimuli moins de 10ms d'intervalle. Réponses TTM, toutefois, restera à 1:1 avec des stimuli au-delà même 300Hz (Tanouye et Wyman, 1980; Engel et Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Des mutations dans le gène shakB, codant pour une drosophile écart de jonction canal ("innexin"), augmenter considérablement la latence de réponse de la voie de GF-TTM (~ 1,5 ms) tandis que la branche GF-DLM est insensible (Allen et Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). La réponse mutant peut être restauré par la stimulation directe ganglions thoraciques, démontrant que l'effet retard n'est pas dû à la transmission neuromusculaire perturbé. La capacité à suivre une stimulation à haute fréquence est également altérée chez ces mutants par rapport au type sauvage mouches, où les voies de GF-DLM et GF-TTM sont généralement en mesure de suivre 10 stimuli avec un rapport de 1:1 jusqu'à 100 Hz et 300 Hz, respectivement. Il est important de noter que ces fréquences sont nettement au-dessus des fréquences de stimulation normale perçue par les muscles contracter pendant le vol soutenue (3-10 Hz) (Hummon et Costello, 1989). Un autre paramètre utilisé pour décrire la stabilité des sorties GFS est la «période réfractaire», ou le temps minimal entre les impulsions de stimulation jumeaux qui produit encore deux réponses du muscle. Le temps varie entre 1-4 réfractaires ms pour TTMS et 7-15 ms pour DLMS. La période relativement longue pour les réfractaires DLMS est due à relativement labile synapses chimiques, à la jonction PSI-DLMn (Tanouye et Wyman, 1980; Gorczyca et Hall, 1984; Engel et Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen et Godenschwege, 2010).

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

Une des choses les plus importantes on doit prêter attention lorsque vous essayez d&#39;obtenir des enregistrements de haute qualité est le bon sens et la santé de la préparation. Idéalement, la mouche doit être encore en vie à la fin de la session d&#39;enregistrement et de répondre à des stimuli électriques. Pour les électrodes d&#39;enregistrement le plus efficacement pénétrer l&#39;exosquelette thoracique, la mouche doit être collé à la surface de manière à former un angle droit avec les électrodes, si nécessaire, l&#39;insertion d&#39;électrodes peut être facilitée par la suppression d&#39;une partie du dorsale thoracique cuticules avec un scalpel, de tungstène exposant ainsi les muscles de vol DLM (cette étape offre un avantage supplémentaire de rendre plus difficile pour les conseils d&#39;électrodes de verre à briser). En outre, les soins doivent être prises pour éviter de pousser les électrodes à travers la DLMS subcuticularly situé et TTMS. La tête de la mouche doit être bien sécurisé pour permettre les électrodes de stimulation pour être correctement insérée dans le cerveau et à les empêcher d&#39;être tiré au cours de la session d&#39;enregistrement. Grâce à sa taille et bien décrit la morphologie, la SFP représente l&#39;une des voies les plus accessibles neuronale chez la drosophile. La perméabilité des synapses électriques aux petites moléculaires colorants traceurs de poids permet la visualisation des neurones couplés électriquement, et plusieurs lignes disponibles GAL4 permettent de manipuler les niveaux d&#39;expression de gènes dans un sous-ensemble de cellules ou groupes de cellules (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) En plus des avantages mentionnés ci-dessus, les deux composantes afférentes et thoraciques des propriétés d&#39;affichage du circuit tels que l&#39;accoutumance, la récupération spontanée et déshabituation, faisant de la SFP drosophile un système modèle commode pour étudier la plasticité neuronale (Engel et Wu, , 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NOM </td><td> ENTREPRISE </td><td> CAT. # </td><td> COMMENTAIRES </td></tr><tr><td> S48 Place Pulse stimulateur </td><td> Instruments Herbe </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Unité de stimulation </td><td> Instruments Herbe </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 Unité RF transformateur d&#39;isolement </td><td> Instruments Herbe </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A Amplificateur à deux canaux microélectrodes intracellulaires </td><td> Obtenir Instruments </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A système d&#39;acquisition de données </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analogique-numérique Digidata 1320 et 9,0 Axoscope logiciels </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Plateforme d&#39;enregistrement avec micromanipulateurs manuels </td><td> Narishige, Sutter Ins., Ins précision mondiale. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Source de lumière </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Sauvage M5 stéréomicroscope </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Table d&#39;isolation vibratoire </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Tube de borosilicate pour microélectrodes </td><td> Instrument Sutter </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipette extracteur </td><td> Instrument Sutter </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34 de calibre, 67 mm (charge d&#39;électrode) </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Outils de microdissection (forceps, ...) </td><td> Outils Fine Science </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Dissection (stéréo) microscope </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Cage de Faraday </td><td> Fabricant inconnu </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Autres: les seringues en plastique, fil de terre de tungstène et de NaOH-aiguisé électrodes de tungstène, KCl, la plate-forme de cire, un PC avec écran ...

enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres géant de d. melanogaster</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Lorsque les adultes effrayés D. melanogaster réagissent en sautant en l&#39;air et de s&#39;envoler. Dans de nombreuses espèces d&#39;invertébrés, dont D. melanogaster, la &quot;fuite&quot; (ou &quot;sursaut&quot;) de réponse lors de la phase adulte est médiée par le circuit multi-composants neuronaux appelé le Système de fibre géante (GFS). La taille comparée grande des neurones, leur morphologie distinctive et une connectivité simple faire la SFP un système modèle intéressant pour étudier les circuits neuronaux. La voie de SFP est composé de deux bilatéralement symétriques géant en fibre (GF) interneurones dont les axones descendent du cerveau, le long de la ligne médiane dans le ganglion thoracique via le connectif cervical. Dans le neuromere mesothoracic (T2) des ganglions ventraux le formulaire GFS électro-chimique des synapses avec 1) la dendrite grande médial de la motoneurones ipsilatéraux (TTMn) qui entraîne le muscle tergotrochanteral (TTM), l&#39;extenseur principal pour le fémur mesothoracic / jambe , et 2) le périphérique synapse interneurone controlatéral (PSI) qui, à leur tour des formes chimiques (cholinergique) des synapses avec les motoneurones (DLMns) des muscles dorsaux longitudinaux (DLMS), l&#39;abaisse-aile. La voie neuronale (s) pour les muscles dorsovental (DVM), les ascenseurs aile, n&#39;a pas encore été élaboré (le DLMS et les docteurs vétérinaires sont connus conjointement comme muscles de vol indirect - ils ne sont pas fixés directement sur les ailes, mais plutôt déplacer le ailes indirectement par fausser la cuticule proximité thoraciques) (King et Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). L&#39;activation de di-synaptique de la DLMS (via PSI) provoque un petit retard, mais important dans le calendrier de la contraction de ces muscles par rapport à l&#39;activation monosynaptique du TTM (~ 0,5 ms), permettant l&#39;TTMS d&#39;abord étendre le fémur et propulser le volée sur le sol. Le TTMS simultanément extensible activer la DLMS qui à son tour mutuellement extensible activer le DVM pour la durée du vol. La voie GF peut être activé soit indirectement par l&#39;application d&#39;une sensorielles (par exemple &quot;l&#39;air-puff» ou «lampes-off&quot;) de relance, ou directement par un stimulus supra-seuil électriques au cerveau (décrite ici). Dans les deux cas, un potentiel d&#39;action atteint la TTMS et DLMS uniquement par le GFS, ISPE, et TTM / DLM motoneurones, bien que le TTMns et DLMns avez d&#39;autres, non encore identifié, des entrées sensorielles. Mesure «réponse de latence&quot; (le temps entre la stimulation et la dépolarisation du muscle) et la &quot;suite à la stimulation à haute fréquence» (le nombre de réponses de succès à un certain nombre de stimuli à haute fréquence) fournit un moyen d&#39;évaluer quantitativement reproductible et l&#39;état fonctionnel des composants SFP, y compris les synapses centrales (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) et les produits chimiques (glutamatergique) jonctions neuromusculaires (TTMn-TTM et DLMn-DLM). Il a été utilisé pour identifier les gènes impliqués dans la formation des synapses centrales et pour évaluer la fonction du SNC.

Le système de fibre Giant est un simple circuit neuronal de l&#39;adulte<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Contenant le plus grand des neurones chez la mouche. Nous décrivons le protocole pour la surveillance de la transmission synaptique dans cette voie par l&#39;enregistrement des potentiels après synaptique dans dorsale longitudinale (DLM) et tergotrochanteral (TTM) des muscles suite à une stimulation directe de la fibre interneurones géants.

Enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster</em

Lorsque les adultes de D. melanogaster sont surpris, ils réagissent en sautant en l'air et en s'envolant. Chez de nombreuses espèces d'invertébrés, dont D. melanogaster, l' « échappement » ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller la transmission synaptique via la voie de la fibre géante en enregistrant les potentiels post-synaptiques provenant d'un muscle dorsal longitudinal ou DLM et d'un muscle trochantérien du Togo ou TTM, suite à la stimulation directe de la fibre géante dans les neurones. Cela est réalisé en fixant tout d'abord correctement une mouche anesthésiée dans une boîte contenant une petite quantité de cire. L'étape suivante de la procédure consiste à insérer des électrodes de stimulation, de référence et d'enregistrement dans la mouche.La dernière étape de la procédure consiste à stimuler le cerveau et à enregistrer les réponses provenant des muscles du saut et du vol. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant des modifications des propriétés fonctionnelles de la voie des fibres géantes en fonction du génotype, de l'âge, de la température, etc. En enregistrant la durée entre le stimulus et la réponse, et en comptant le nombre de réponses réussies après une série de stimuli à haute fréquence.Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions clés dans le domaine de la neurophysiologie et permet d'examiner les propriétés fonctionnelles des voies neuronales. Cette technique peut être utilisée soit comme une expérience introductive suivie d'une analyse génétique ou moléculaire, soit comme un moyen d'évaluer les propriétés physiologiques et fonctionnelles chez des animaux porteurs d'une mutation connue. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.Étant donné que les étapes de préparation et d'induction de l'incapacité prennent un certain temps à être maîtrisées, et que les mouches sont comparativement petites, un certain niveau de stabilité et de coordination doit être acquis avant de pouvoir réaliser correctement les expériences. Ces expériences utilisent un dispositif standard d'électrophysiologie composé d'un stimulateur, d'une unité d'isolation du stimulus, de deux amplificateurs d'électrodes microscopiques, d'un système d'acquisition de données et d'un ordinateur muni d'un logiciel de collecte.Les équipements supplémentaires comprennent une cage de Faraday, un microscope stéréo sur un support articulé, une table d'isolation des vibrations, une source lumineuse et une plateforme d'enregistrement. Cinq micromanipulateurs sont utilisés. Deux micromanipulateurs nécessitent des commandes fines pour positionner les électrodes d'enregistrement, tandis que les trois autres micromanipulateurs nécessitent uniquement des commandes grossières.Pour positionner les deux électrodes de stimulation et l'électrode de masse, le manipulateur destiné à l'électrode d'enregistrement du DLM est placé à l'extrémité caudale de la préparation. Le micro-manipulateur destiné à l'électrode d'enregistrement du TTM est placé entre l'expérimentateur et le côté de la préparation. Les deux micro-manipulateurs destinés aux électrodes de stimulation sont placés à l'extrémité céphalique de la préparation.Le micromanipulateur pour l'électrode de terre est placé du côté opposé de la préparation. Tirez des microélectrodes en verre pour l'enregistrement ayant des résistances de 40 à 60 mégohms et rangez-les à plat dans une boîte supportée par de la cire. Utilisez deux électrodes en tungstène affinées électromagnétiquement pour la stimulation.Utilisez un fil tige ou une troisième électrode fabriquée par voie électromagnétique. En tant que masse, fixez les électrodes de stimulation et de masse sur les micromanipulateurs avant le début de la séance expérimentale. Elles n'auront pas besoin d'être remplacées pendant toute la durée de la séance.Une fois votre équipement installé, il est temps de préparer les mouches. Anesthésiez les mouches en les refroidissant sur de la glace pendant 10 à 15 minutes. Utilisez une pince pour transférer délicatement la mouche par ses pattes vers une boîte contenant une plateforme en cire molle inclinée d’environ 45 degrés.L'étape suivante consiste à fixer la mouche dans la cire. Orientez la mouche avec la face ventrale vers le bas et son extrémité antérieure dirigée vers le haut, sur la pente. À l'aide d'une pince fine, étendez les pattes vers l'extérieur par paires et enfoncez-les dans la cire.Une fois que vous êtes familiarisé avec l'emplacement des muscles à enregistrer avant de commencer cette expérience, le muscle dorsal longitudinal (DLM) et le muscle turga TRO cantoral (TTM), les sites d'insertion sous-cuticulaires des DLM correspondent à la région située entre la ligne médiane du thorax et les soies dorsales antérieures. Les sites d'insertion du TTM se trouvent à la face dorsale des soies supra-alaires postérieures et antérieures. Veillez à ce que les ailes n'entravent pas l'accès aux fibres du DLM ou du TTM ; écartez les ailes et collez-les à la cire. À l'aide d'une pince fine, tirez délicatement le psis vers l'extérieur et fixez-le en l'immergeant dans la cire.Il s'agit d'une étape cruciale qui nécessite un certain entraînement, car le proboscis est mou et peut facilement se détacher du reste de la tête. Si cela se produit, jetez la drosophile et recommencez. Un échec à bien fixer la tête de cette manière entraîne des difficultés lors de l'insertion des électrodes de stimulation à travers les yeux.Une fois la drosophile fixée à la cire, placer la préparation sous le microscope stéréo à l'intérieur de la cage de Faraday, en orientant la drosophile sur le côté, la tête tournée vers la droite de l'expérimentateur. L'étape suivante consiste à insérer les électrodes. Rapprocher les électrodes des sites d'insertion à l'aide des micromanipulateurs afin de faciliter leur positionnement correct et les enregistrements ultérieurs ; sans regarder à travers le microscope, abaisser l'électrode de terre à l'extrémité postérieure de l'abdomen à l'aide des molettes de réglage du micromanipulateur, puis placer les électrodes de stimulation en tungstène aiguisées dans le cerveau.Utilisez le micromanipulateur pour positionner la pointe de l'une des électrodes de manière à ce qu'elle touche légèrement l'un des yeux de la drosophile. Faites de même avec l'autre électrode, de sorte que les deux électrodes effleurent juste l'extérieur de chaque œil. Ensuite, poussez les électrodes vers l'intérieur.Tournez chaque œil d’environ deux à trois millimètres afin que les extrémités des électrodes atteignent le cerveau situé à l’arrière de la capsule céphalique. Des électrodes correctement positionnées activeront le système de fibre géante, permettant de vérifier que les électrodes de stimulation sont bien placées. Appliquez un bref stimulus de 30 à 60 volts entre les électrodes de stimulation et observez un mouvement des ailes ainsi que des contractions des muscles du vol ou des pattes.L'étape suivante consiste à remplir par le fond les microélectrodes en verre avec du chlorure de potassium à trois molaire à l'aide d'une seringue en plastique Hamilton ou tirée à la chaleur, puis à les placer dans les micromanipulateurs à commande fine. Les microélectrodes correctement insérées peuvent être utilisées pour plusieurs séries d'expériences. La première électrode d'enregistrement sera insérée dans une fibre A DLM.Il existe deux DLM symétriques bilatéralement. Chacun est composé de six fibres musculaires individuelles. Les enregistrements peuvent être réalisés sur l'une quelconque des six fibres ; toutefois, les fibres DLM 45 A et 45 B sont les plus couramment utilisées, en raison de leur bonne accessibilité par la face dorsale de la cuticule thoracique, et du fait que les deux fibres sont innervées par le même motoneurone.À l’aide du micromanipulateur placé à l’extrémité de l’insérateur de préparation, introduire l’électrode d’enregistrement dans la fibre DLM 45 A ou B du côté de la mouche qui est le plus éloigné. La pente de la plateforme permet à l’électrode DLM d’entrer dans la cuticule dorsale selon un angle de 60 à 90 degrés, ce qui facilite la pénétration à l’aide du logiciel en mode oscilloscope. Observer l’écran d’ordinateur pendant l’introduction de l’électrode d’enregistrement dans le thorax.Lorsque l'électrode est entrée dans un muscle, la ligne de base chute vers une valeur proche de zéro ou négative ; effectuez un test avec un stimulus unique pour vérifier si vous pouvez observer la réponse musculaire. Insérez l'autre électrode d'enregistrement dans le muscle TTM du côté de la drosophile qui est le plus proche de vous. Cette électrode est insérée latéralement devant vous en raison de l'emplacement du site d'insertion musculaire.Encore une fois, observez l'écran pendant que vous effectuez cette manipulation. Dès que le tracé indique que l'électrode se trouve dans le muscle, effectuez un test à l'aide d'un stimulus unique afin d'obtenir une réponse musculaire. Pour commencer à stimuler le cerveau et enregistrer les réponses provenant des muscles des pattes et des muscles du vol, appliquez un stimulus de 0,03 milliseconde entre les électrodes de stimulation, en partant de 30 volts et en augmentant jusqu'à 60 volts, jusqu'à ce que vous observiez un tressaillement musculaire et une dépolarisation de la cellule musculaire sur l'écran de l'ordinateur.Pour la suite de l'expérience, réglez la tension à cinq à dix volts au-dessus du seuil de réponse. Pour mesurer la latence de réponse, appliquez au moins cinq stimulations uniques avec une période de repos de cinq secondes entre chaque stimulus.Déterminez la fréquence de suivi en appliquant des trains de stimulations à différentes fréquences. Généralement, 10 trains de 10 stimulations sont appliqués à 100 hertz, 200 hertz et 300 hertz, avec une période de repos de deux secondes entre chaque train de stimulations. Cette figure montre les réponses enregistrées à partir des muscles TTM et dlm suite à une stimulation unique appliquée au cerveau.La latence de réponse correspond au temps entre la stimulation du cerveau et la dépolarisation du muscle. Une préparation saine et une technique d’enregistrement adéquate se traduisent par des latences comprises entre 0,7 et 1,2 milliseconde pour la voie G-F-T-T-M et entre 1,2 et 1,7 milliseconde pour la voie GF DLM. Les latences peuvent varier selon le génotype, le fonds génétique, la température et l’âge, comme illustré ici.Les enregistrements provenant du TTM montrent une plus grande variabilité en ce qui concerne l'amplitude et la forme du potentiel post-synaptique par rapport à ceux des grandes fibres du DLM. Cette variabilité accrue est due à la petite taille des fibres musculaires du TTM. Cette variabilité, cependant, n'affecte pas les valeurs de latence de réponse de la voie du neurone géant vers le TTM.Cette figure montre la stimulation du TTM et du DLM à 100 hertz et à 200 hertz à 100 hertz. Les deux, les TTM et les DLM, répondent aux 10 stimulations à 200 hertz. Les réponses du TTM restent univoques, cependant, les réponses du DLM commencent à échouer.La raison pour laquelle le DLM ne parvient pas à suivre des fréquences de stimulation supérieures à 100 hertz est que la synapse chimique intermédiaire entre deux interneurones ne dispose pas d'un temps suffisant pour se rétablir entre les stimuli. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de surveiller la neurotransmission via la voie du fibre géant.Cela se fait en stimulant la fibre géante menant aux neurones du cerveau, puis en enregistrant l'activité d'un muscle de saut et des muscles du vol situés dans le thorax.

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Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.

Méthodes électrophysiologiques pour l&#39;enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile

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Nanoinjection paires et test d&#39;électrophysiologie à l&#39;écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant

La vidéo démontre l’enregistrement extracellulaire de l’activité neuronale du système nerveux central (SNC) de larves de drosophile. Le SNC transecté est positionné dans une chambre d’enregistrement, et l’activité électrique d’un nerf descendant est enregistrée pour établir la fréquence de décharge de base. Un agent d'essai est ensuite introduit et la variation de la fréquence de décharge est enregistrée pour déterminer l'effet excitateur ou inhibiteur de l'agent.

Enregistrement extracellulaire de l’activité électrique dans le système nerveux central de la drosophile

Ce protocole décrit l'enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d'action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.

Enregistrement électrophysiologique De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Goût Sensilles

Des microélectrodes tranchantes permettent une caractérisation électrophysiologique précise des photorécepteurs et de la sortie d’interneurones visuels chez la drosophile vivante. Nous montrons ici comment utiliser cette méthode pour enregistrer les réponses en tension de haute qualité de cellules individuelles à une stimulation lumineuse contrôlée. Cette méthode est idéale pour étudier le traitement de l’information neuronale dans les yeux composés d’insectes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Les enregistrements de cellules entières des photorécepteurs de Drosophila melanogaster permettent de mesurer des bosses sombres spontanées, des bosses quantiques, des réponses macroscopiques à la lumière et des relations courant-tension dans diverses conditions. En combinaison avec des outils de manipulation génétique de D. melanogaster, cette méthode permet d’étudier la voie de signalisation inositol-lipidique ubiquitaire et sa cible, le canal TRP.

Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs

Courants synaptiques sont enregistrables circonscrits de visualisé boutons synaptiques à la jonction neuromusculaire Drosophila troisième stade larvaire des larves. Cette technique permet la surveillance de l’activité d’un seul bouton synaptique.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

Ce protocole démontre l’ablation cellulaire au laser de neurones individuels chez des larves de drosophile intactes. La méthode permet d’étudier l’effet de la réduction de la compétition entre les neurones du système nerveux en développement.

L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique

Apprenez à enregistrer les potentiels post-synaptiques dans les muscles DLM et TTM de Drosophila melanogaster pour étudier la transmission synaptique dans la voie des fibres Géant. Cette méthode électrophysiologique permet d'évaluer les propriétés fonctionnelles des circuits neuronaux.

Enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster

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