Visualisation des protéines de germination dans la membrane interne de spores bactériennes

Prenez comme référence une lame contenant des spores bactériennes dormantes et des microsphères fluorescentes.

Les spores portent des rapporteurs fluorescents rouges et verts pour les protéines de germination, la membrane interne étant colorée à l’aide d’un colorant lipophile.

Montez la lame sur un microscope à éclairage structuré ou une carte SIM équipée d’un objectif à immersion dans l’huile.

Localisez les microsphères fluorescentes et ajustez la mise au point pour minimiser le flou de l’image.

Ensuite, utilisez la lumière transmise pour localiser les spores bactériennes.

Passez en mode SIM et illuminez les spores pour exciter les fluorophores.

Acquérez des images de fluorescence haute résolution sur toute la profondeur des spores.

Sur la membrane interne lipophile colorée par un colorant, les protéines de germination apparaissent sous forme de foyers rouges et verts distincts. Cela permet une cartographie précise de l’emplacement des protéines de germination dans les spores bactériennes.

Pour l’imagerie des échantillons, placez la lame sur un microscope à éclairage structuré équipé d’un objectif à huile 100X, et concentrez-vous sur les microsphères fluorescentes de 100 nanomètres.

Ajustez la bague de correction sur l’objectif 100X jusqu’à ce qu’une fonction d’étalement du point symétrique soit obtenue pour minimiser le flou des images, et sélectionnez un champ de vision avec environ 10 microsphères fluorescentes rondes. Appliquez un réglage de mise au point du réseau pour les longueurs d’onde d’excitation désignées, dans ce cas, 561 et 488 nanomètres, comme guide pour le logiciel d’analyse d’images avant de faire la mise au point sur les spores avec la lumière de transmission. Capturez une image de lumière de transmission en mode moyen 16X avec des expositions de 20 millisecondes pour chaque image.

Ensuite, capturez des images fluorescentes brutes des spores avec le mode d’éclairage 3D-SIM.