Transfection d’amibes de type sauvage par électroporation avec support d’alimentation bactérienne

Commencez avec des cellules d’amibe Dictyostelium discoideum de type sauvage en suspension dans un tampon froid.

Le tampon fournit un environnement ionique qui maintient la stabilité de la membrane.

Ensuite, ajoutez les cellules d’amibe dans un tube contenant un plasmide avec le gène cible.

Mélangez doucement la solution pour mettre les plasmides en contact étroit avec la surface de l’amibe.

Transférez ce mélange dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie et effectuez l’électroporation.

Lors de l’électroporation, les impulsions électriques créent des pores transitoires dans la membrane cellulaire.

Le plasmide pénètre par ces pores dans le cytoplasme et se déplace ensuite vers le noyau.

Ensuite, transférez les cellules d’amibes dans une boîte de Pétri contenant un milieu liquide complété par des bactéries nourricières.

L’amibe consomme des bactéries par phagocytose, fournissant des nutriments essentiels à la récupération cellulaire et permettant l’expression plasmidique.

Les bactéries nourricières favorisent la transfection dans les cellules d’amibes de type sauvage, sans avoir besoin de souches spéciales qui se développent sans bactéries.

Remettez les cellules en suspension dans la mémoire tampon H40.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules dans un tube contenant un à deux microgrammes d’ADN. Pipette de haut en bas pour mélanger et transférer le mélange d’ADN cellulaire dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie.

N’ajoutez pas plus de deux microgrammes d’ADN. Une concentration plus élevée d’ADN est toxique pour les cellules et réduit l’efficacité.

Après l’électroporation, transférez immédiatement les cellules dans une boîte de Pétri de 10 centimètres préparée et laissez les cellules récupérer pendant cinq heures.