Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Commencer avec une solution de résine échangeuse d’ions contenant des groupes fonctionnels chargés positivement pour la liaison sélective des protéines.
Ensuite, prenez un extrait de protéine obtenu à partir de cellules bactériennes de l’hôte modifiées pour surexprimer un facteur de virulence de la bactérie pathogène Helicobacter pylori.
L’extrait contient le facteur de virulence cible ainsi que des protéines de la cellule hôte dans un tampon à pH 8.
Mélangez l’extrait de protéine avec la résine et incubez en agitant pour assurer une interaction protéine-résine uniforme.
Les protéines de l’hôte, ayant des points isoélectriques inférieurs au pH tampon, deviennent chargées négativement et se lient à la résine chargée positivement.
La protéine cible, avec un point isoélectrique proche du pH tampon, reste en grande partie non chargée et reste non liée.
Transférez la suspension protéine-résine dans une colonne de chromatographie et laissez la résine se déposer.
Recueillir la phase liquide contenant la protéine cible non liée.
Rincez la résine avec le tampon pour assurer une récupération maximale de la protéine cible.
Pour préparer 15 millilitres de résine DEAE, suspendez 0,6 gramme de poudre sèche de résine DEAE dans 30 millilitres de tampon Tris-HCl à température ambiante pendant au moins une journée.
Centrifugez la résine à 10 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant une minute, puis retirez et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de tampon Tris-HCl. Après avoir répété la centrifugation, quatre autres étapes de remise en suspension, stockez les 15 millilitres de résine décantée à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.
En travaillant à quatre degrés Celsius, ajoutez 45 millilitres de protéines solubles préparées à 15 millilitres de résine et transférez dans un bécher de 100 millilitres avec barre d’agitation. Mélangez la bouillie de résine protéinée à l’aide d’une plaque d’agitation à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, versez la boue de résine protéique dans une colonne en plastique ou en verre équipée d’un robinet d’arrêt et laissez la résine se déposer sous l’effet de la gravité.
Ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre à la solution protéique de s’écouler dans la colonne par gravité jusqu’à ce que le niveau de liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Collectez le flux sous forme de fraction non liée qui contient la protéine d’activation des neutrophiles purifiée. Ajoutez 15 millilitres de tampon Tris-HCl glacé dans la colonne.
Ouvrez à nouveau le robinet d’arrêt pour permettre au tampon de lavage de traverser la colonne par gravité jusqu’à ce que le niveau de liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Collectez le débit en tant que fraction de lavage. Répétez le lavage avec un tampon glacé quatre fois de plus pour recueillir les fractions de lavage supplémentaires.