Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:00 min • October 30th, 2025
Prenez une suspension homogène de caséum - la matière nécrotique et riche en lipides des lésions de tuberculose, qui abrite des mycobactéries tolérantes aux médicaments en son cœur.
Ajouter le médicament d’essai à l’homogénat et au vortex pour faciliter son interaction avec la matrice du caséum.
Placez un insert de dialyse à équilibre rapide contenant les chambres donneuse et réceptrice séparées par une membrane semi-perméable dans la plaque de base.
Chargez l’homogénat enrichi du médicament dans la chambre donneuse et ajoutez un tampon dans la chambre réceptrice.
Scellez la plaque et incubez en rotation.
Pendant l’incubation, le médicament libre se diffuse à travers la membrane, atteignant l’équilibre entre les deux chambres.
Une fois l’équilibre atteint, diluer l’échantillon donneur avec un tampon et l’échantillon récepteur avec un homogénat sans médicament pour normaliser les conditions matricielles pour la quantification du médicament.
Enfin, quantifiez la concentration du médicament et calculez la fraction médicamenteuse non liée ou fu.
Le fu reflète le médicament libre disponible pour se diffuser dans le caséum et atteindre les mycobactéries tolérantes aux médicaments.
Ajouter 6,5 microlitres de la pâte d’essai préparée à 643,5 microlitres d’homogénat. Pour atteindre la concentration finale de cinq micromolaires et vortex.
Ensuite, placez les inserts rouges dans la plaque de base. Préparez les inserts pour chaque essai, chaque composé en trois exemplaires.
Ajoutez 200 microlitres de la matrice enrichie du médicament dans la chambre donneuse rouge de chaque insert rouge. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de PBS dans chaque chambre réceptrice.
Placez un joint adhésif sur la plaque et incubez-le à 37 degrés Celsius sur le mélangeur thermique à 200 rotations par minute pendant quatre heures. Après l’incubation, mélangez doucement le contenu des chambres donneuse et réceptrice en pipetant de haut en bas deux à trois fois. Transférez 20 microlitres d’homogénat de chacune des chambres donneuses à 20 microlitres de PBS propre dans un tube de 1,5 millilitre.
De même, transférez 20 microlitres d’aliquotes d’échantillons PBS des chambres réceptrices à 20 microlitres d’homogénat propre.
L’appariement matriciel élimine le besoin de deux courbes de vision des couleurs distinctes dans l’homogénat et le PBS à réaliser pour l’analyse quantitative. Le contenu de la chambre donneuse peut sédimenter avec le temps. Mélangez délicatement le contenu par pipetage avant de prélever les aliquotes.