Microscopie microfluidique time-lapse pour étudier la persistance des antibiotiques chez les bactéries

Commencez par des cellules bactériennes à croissance exponentielle exprimant une protéine de fusion de liaison à l’ADN marquée par fluorescence pour visualiser le nucléoïde.

Ajoutez les cellules aux entrées d’une plaque microfluidique pré-préparée.

Ensuite, introduisez des milieux contenant des antibiotiques et des milieux sans antibiotiques dans des entrées de solution séparées.

Scellez la plaque, montez-la sur la platine du microscope et lancez l’imagerie en accéléré.

Tout d’abord, chargez les cellules dans la chambre de culture.

Ensuite, perfuser un milieu sans antibiotique dans la chambre pour favoriser une croissance cellulaire exponentielle.

Enfin, introduisez le milieu contenant des antibiotiques.

L’antibiotique induit des cassures de l’ADN double brin, tuant les cellules sensibles. Ces cellules présentent des nucléoïdes compactés, non répliquants et à fluorescence stable.

Revenez à des milieux sans antibiotiques pour favoriser la guérison.

Les cellules persistantes - une petite sous-population qui survit au traitement antibiotique - reprennent la réplication de l’ADN, s’allongent et se divisent.

Cette récupération conduit à une fluorescence accrue dans les cellules persistantes, ce qui permet de les distinguer visuellement des cellules sensibles.

Retirez la solution de conservation de chaque puits de la plaque microfluidique et remplacez-la par un milieu de culture frais. Scellez la plaque microfluidique avec le système de collecteur en cliquant sur le bouton Sceller ou via le logiciel microfluidique.

Ensuite, sur l’interface du logiciel microfluidique, effectuez une première séquence d’amorçage en cliquant sur Run Liquid Amoring Sequence. Incuber la plaque dans une armoire thermostatique du microscope à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant de commencer l’imagerie microscopique. Démarrez ensuite une deuxième séquence d’amorçage liquide avant de commencer l’expérience.

Scellez la plaque microfluidique en cliquant sur Desceller la plaque sur l’interface du logiciel microfluidique. Remplacez le milieu dans les puits par 200 microlitres de milieu frais, un milieu frais contenant un antibiotique, et un échantillon de culture dilué à 0,01 DO dans le milieu frais. Après avoir scellé la plaque microfluidique comme démontré précédemment, placez la plaque sur l’objectif du microscope à l’intérieur de l’armoire du microscope.

Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur Exécuter la séquence de chargement des cellules pour permettre le chargement des cellules dans la plaque microfluidique. Réglez une mise au point optimale à l’aide du mode de lumière transmise et sélectionnez plusieurs régions d’intérêt où un nombre de cellules approprié allant jusqu’à 300 cellules par champ peut être observé. Sur le logiciel microfluidique, modifiez l’exécution d’une séquence personnalisée pour programmer l’injection d’un milieu frais à 6,9 kilopascals pendant six heures dans les puits un et deux, suivie d’un milieu contenant un antibiotique à 6,9 kilopascals pendant six heures jusqu’au puits trois, et enfin du milieu frais à 6,9 kilopascals pendant 24 heures dans les puits quatre et cinq.

Effectuez une imagerie microscopique en mode time-lapse avec une image toutes les 15 minutes en utilisant la lumière transmise et la source lumineuse d’excitation du rapporteur fluorescent, et démarrez le programme microfluidique. Ouvrez le logiciel ImageJ ou Fiji sur l’ordinateur et faites glisser les images de microscopie time-lapse hyperstack dans la barre de chargement Fidji. Utilisez Image, puis Couleur, puis Rendre composite pour fusionner les différents canaux de l’hyperstack.

Utilisez Image, Couleur, puis Organiser les canaux si ceux-ci ne correspondent pas à la couleur souhaitée. Ouvrez le plugin MicrobeJ et détectez les cellules bactériennes à l’aide de l’interface d’édition manuelle. Supprimez les cellules détectées automatiquement et tracez manuellement le contour des cellules persistantes qui vous intéressent image par image.

Après la détection, utilisez l’icône Result dans l’interface d’édition manuelle de MicrobeJ pour générer une table ResultJ. Utilisez la table ResultJ pour obtenir des informations sur les différents paramètres d’intérêt de l’analyse à cellule unique et enregistrez le fichier ResultJ.