Technique de préparation d’une culture bactérienne monoclonale

Commencez par une culture bactérienne et effectuez une dilution en série pour réduire la densité cellulaire.

Prenez une petite aliquote de la dilution finale et placez-la sur une plaque de gélose.

Ajoutez des billes de verre stériles et secouez doucement la plaque pour assurer la séparation spatiale des cellules, ce qui est essentiel pour obtenir des colonies bien isolées.

Retirez les perles de verre, puis retournez la plaque et incuberez.

Les cellules individuelles prolifèrent et forment des colonies distinctes, générant une culture monoclonale dans laquelle chaque colonie est constituée d’une population bactérienne génétiquement uniforme.

Prélevez des colonies individuelles et transférez-les dans des tubes séparés contenant un milieu liquide.

Incuber les tubes avec agitation. Après l’incubation, évaluer la turbidité de chaque culture.

Les cellules bactériennes en suspension dans le milieu diffusent la lumière, ce qui rend les cultures plus troubles avec l’augmentation de la densité cellulaire.

Sélectionnez le tube avec la turbidité la plus élevée, ce qui indique la population bactérienne monoclonale la plus dense, pour les applications en aval.

Étiquetez les trois bouteilles préparées avec 100 millilitres de bouillon LB Lennox avec le numéro un, le numéro deux et le numéro trois.

Pipetez 0,1 millilitres de la culture bactérienne obtenue dans le premier flacon. Fermez le flacon et faites-le pivoter à la main pendant une minute pour obtenir une solution homogène. Ensuite, pipetez 0,1 millilitres de la bouteille numéro un dans la bouteille numéro deux. Encore une fois, bouchez la bouteille et balancez-la à la main pendant une minute. Effectuez la dernière dilution en pipetant 0,1 millilitres de la bouteille numéro deux dans la bouteille numéro trois. Boucher le flacon et le secouer à la main pendant une minute.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de la solution sur chacune des quatre boîtes de Pétri. Ensuite, placez quatre perles de verre autoclavées de trois millimètres de diamètre dans chacune des boîtes de Pétri. Fermez les couvercles des boîtes de Pétri et secouez-les à la main pendant une minute.

Lorsque vous avez terminé, retournez les boîtes de Pétri et incubez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

À l’aide d’une spatule en acier inoxydable, prélevez les bactéries monoclonales résultantes dans les quatre boîtes de Pétri et placez-les dans les sept tubes restants contenant 12,5 millilitres de bouillon LB Lennox. Laissez les tubes dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, puis choisissez celui qui diffuse le plus de lumière à l’aide de la méthode colorimétrique visuelle.