Production et dépôt par aérosol de spores de Bacillus subtilis

Commencez par une culture de Bacillus subtilis, une bactérie sporulée très résistante.

Inoculer la culture dans un milieu pauvre en nutriments et incuber avec aération pour induire la sporulation.

Les cellules sporulantes produisent des spores dormantes avec des couches protectrices.

Transférez la culture dans un tube et centrifugez-la pour granuler les spores. Retirez le surnageant contenant les cellules résiduelles et les débris.

Lavez la pastille avec de l’eau distillée stérile, répétez la centrifugation et remettez les spores en suspension dans de l’eau stérile.

À l’aide d’un microscope à contraste de phase, confirmez la pureté des spores en identifiant les spores brillantes et en vérifiant l’absence de contaminants.

Effectuez des dilutions en série des spores, plaquez sur de la gélose nutritive et incubez pour permettre la germination des spores viables en colonies. Comptez les colonies pour déterminer la concentration des spores.

En fonction de cette concentration, ajustez la quantité de spores et chargez l’échantillon dilué dans une buse aérosol. Vaporisez-le sur une surface en verre stérile où la suspension sèche rapidement pour former une monocouche mince et uniforme de spores.

Pour effectuer la production de spores, transférez une culture nocturne de 5 millilitres de la souche respective de B. subtilis complétée par des antibiotiques appropriés dans 200 millilitres de milieu de sporulation liquide Schaeffer double concentration et cultivez-la avec une aération vigoureuse à 37 degrés Celsius pendant au moins 72 heures ou plus jusqu’à ce que plus de 95 % de la culture ait été spoulée. Récolter les spores dans des tubes de 15 millilitres par centrifugation à 3000 g pendant 15 minutes et purifier les échantillons à l’aide de_H2O distillé stérile en plusieurs lavages.

Vérifiez la pureté et l’état de germination par microscopie à contraste de phase et assurez-vous que les suspensions de spores sont composées de plus de 99 % de spores brillantes de phase et sont exemptes de cellules végétatives, de spores germées et de débris cellulaires, sinon d’autres expériences de microscopie peuvent être perturbées. Déterminer le titre de spores en plaquant 50 microlitres de dilutions en série dix fois sur de la gélose LB pour calculer les UFC et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après la détermination de l’UFC, ajuster l’échantillon à 10 à neuf spores par millilitre en concentrant ou en utilisant de l’eau stérile pour diluer les échantillons.

Placez un support d’échantillon sous la forme de lames microscopiques stérilisées ou de lamelles rondes de 25 millimètres à l’intérieur de l’unité de pulvérisation d’aérosol à commande électrique, dans l’alignement de la buse. Transférez la culture de spores à l’entrée du liquide de la buse et lancez la pulvérisation à 0,15 seconde avec une pression de 1,3 bar. La suspension de spores pulvérisée forme un film mince sur la lame microscopique qui sèche rapidement en quelques secondes pour former une monocouche de spores uniformément répartie. Conservez les supports d’échantillons traités dans un récipient stérile à température ambiante.