JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:07 min • October 30th, 2025
Prélever des échantillons séparés de cellules vivantes et mortes de Microcystis aeruginosa .
Mélangez les échantillons pour créer une population combinée.
Microcystis contient de la phycocyanine, un pigment autofluorescent qui reste intact dans les cellules vivantes mais se dégrade dans les cellules mortes.
Vortex l’échantillon pour briser les amas et générer une suspension uniforme à cellule unique.
Ajoutez une sonde fluorescente imperméable à la membrane cellulaire et liant les acides nucléiques, et incubez l’échantillon dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment.
La sonde pénètre sélectivement dans les cellules mortes à travers leurs membranes endommagées et se lie à l’ADN intracellulaire.
Passez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux pour mesurer l’autofluorescence de la phycocyanine et la fluorescence de la sonde d’acide nucléique à l’aide de lasers de longueur d’onde d’excitation appropriés.
Les cellules vivantes émettent une forte autofluorescence de la phycocyanine mais ne montrent aucun signal de sonde.
En revanche, les cellules mortes présentent une émission de pigment réduite et une fluorescence de sonde élevée, confirmant les dommages à la membrane.
Cela permet d’identifier les cellules vivantes riches en pigments des cellules mortes.
Pour optimiser l’absorption des cellules de la sonde moléculaire, exposez la moitié de la monoculture préalablement préparée aux conditions appropriées pour générer un témoin mort. Vérifiez les variations dans le micro-environnement de l’échantillon pour confirmer la mort de la culture. Et puis désagréger la formation de la colonie comme nous venons de le démontrer.
Ensuite, sélectionnez un laser de 488 nanomètres à côté d’un détecteur capable d’enregistrer la fluorescence des sondes d’acide nucléique vertes et orange. Et le laser de 640 nanomètres pour enregistrer les signaux de phycocyanine à travers leurs détecteurs respectifs.