Quantification des unités formant des colonies de bactéries associées à l’intestin chez la drosophile

Commencez avec une microplaque contenant des homogénats préparés à partir de mouches drosophiles . Ces mouches abritaient une population contrôlée d’une bactérie spécifique dans leur intestin.

Les homogénats contiennent des tissus de mouches lysés et libérés par des bactéries intestinales.

Aspirez les bactéries en suspension et diluez-les en série sur plusieurs microplaques.

Repérez les petits volumes de chaque dilution sur des plaques de gélose, en veillant à ce que les gouttelettes restent séparées.

Incuber pour permettre aux bactéries de proliférer en colonies visibles.

Capturez des images des plaques pour quantifier les unités formant colonies (UFC), qui représentent le nombre de cellules bactériennes viables capables de former des colonies individuelles.

À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, alignez chaque image à l’aide d’une ligne de référence, définissez une limite et appliquez une grille uniforme pour la segmenter en zones de comptage, chacune correspondant à un seul point.

Ajustez le seuil de luminosité pour distinguer les colonies individuelles de l’arrière-plan, puis exécutez l’analyse pour compter les colonies à chaque endroit et quantifier les UFC.

Placez trois plaques de croissance rectangulaires de gélose MRS avec leurs couvercles ouverts dans l’enceinte de biosécurité pour sécher pendant au moins 10 minutes. Préparez deux plaques de dilution en ajoutant 100 microlitres de PBS dans chaque puits d’une plaque stérile à 96 puits à l’aide d’une pipette à 96 canaux. Chargez un rack de pointes P-20 sur le pipeteur à 96 canaux.

Effectuez une dilution de 1:10 en aspirant 11,1 microlitres d’homogénat à partir de la plaque d’échantillon. Maintenant, distribuez-le dans la première plaque de dilution contenant 100 microlitres de PBS stérile par puits. Maintenez la plaque de dilution sur l’agitateur de plaques pendant 10 secondes à 600 tr/min.

Mélangez à nouveau en pipetant de haut en bas au moins 10 fois. Transférez 11,1 microlitres de la première plaque de dilution à la deuxième plaque de dilution et répétez les étapes de mélange pour toute dilution supplémentaire. Pour les plaques d’observation, chargez deux microlitres de chaque puits dans la pipette à 96 canaux.

Abaissez lentement la tête du pipeteur sur la plaque, en évitant de poignarder l’agar, et assurez-vous que tous les points ont été distribués. Ensuite, vérifiez que les taches liquides pénètrent rapidement dans la gélose et ne coulent pas ensemble. Répétez le processus de placage pour les plaques de dilution restantes comme décrit dans le manuscrit.

Une fois que le liquide a été complètement absorbé dans la gélose, retournez les plaques et incubez-les jusqu’à ce que les colonies aient atteint leur taille optimale. Organisez les plaques de manière logique et conservez-les dans un ordre précis pendant la photographie. Orientez-les de manière à ce que A1 soit dans le coin supérieur gauche pour toutes les plaques.

Après avoir retiré le couvercle de la plaque, placez la plaque sur la platine avec A1 orienté dans le bon coin. Imagez les plaques. Transférez les images sur un ordinateur et renommez-les, y compris le nom de l’expérience, le type de support, le facteur de dilution et d’autres détails pertinents.

Organisez les images à traiter pour la quantification dans un dossier. Les noms de fichiers qui distinguent les plaques deviennent des titres de colonne pour chaque ensemble de comptes dans la feuille de calcul de sortie. Créez des sous-dossiers nommés Recadrés et Reçus dans le dossier.

Ces dossiers recevront les fichiers de sortie. Lancez maintenant le plugin Croptacular à partir d’ImageJ et cliquez sur OK pour commencer le recadrage. Une boîte de dialogue permettant de choisir le dossier source apparaîtra.

Cliquez sur OK. Sélectionnez le dossier source, puis cliquez sur Ouvrir. Cliquez ensuite sur OK dans la boîte de dialogue permettant de choisir le répertoire de destination. Sélectionnez le dossier de destination et appuyez sur Ouvrir.

Si l’image est déjà droite, appuyez simplement sur Espace. Sinon, redressez l’image en traçant une ligne le long d’un bord qui doit devenir horizontal. Redessinez la ligne autant de fois que nécessaire si l’image n’apparaît pas droite.

Ensuite, dessinez une boîte de délimitation pour la zone de comptage et ajustez sa taille et sa proportion jusqu’à ce que tous les points soient à l’intérieur de leurs cellules. Faites glisser le curseur à l’extérieur de la zone de délimitation pour actualiser la grille. Lorsque la grille semble bonne, appuyez sur Espace.

Étant donné que le plugin suppose que toutes les photos sont alignées de la même manière, assurez-vous que l’image suivante pivote automatiquement dans le même angle que la première. Si c’est exact, appuyez sur Espace pour continuer. Sinon, redressez l’image comme précédemment.

La grille rappelle également la même position que l’image précédente. Ajustez si nécessaire et appuyez sur Espace. Lancez Count-On-It et sélectionnez Gridiron.

Définissez le seuil d’intensité de la colonie en fonction d’une valeur d’intensité de pixel supérieure et inférieure. Rendez le seuil aussi strict que possible, tout en sélectionnant toutes les colonies. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue Action requise lorsque le seuil est satisfaisant, puis cliquez sur OK pour continuer.

Sur la première image, la possibilité est donnée de continuer ou de revenir au menu de configuration. Pour poursuivre le traitement par lots, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez un dossier pour conserver le tableau des reçus et des résultats. Utilisez le dossier Reçus créé précédemment.

Après la première image, les images suivantes auront par défaut le même seuil que les paramètres précédents. Cliquez sur OK pour utiliser ces paramètres ou les ajuster.