Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:38 min • October 30th, 2025
Prenez une culture de Mycobacterium smegmatis hébergeant des gènes inductibles pour la GFP et une luciférase mutante marquée par un signal de sécrétion.
Le gène mutant code pour une luciférase inactive, mais une erreur de traduction naturelle lors de la synthèse des protéines produit une enzyme active.
La GFP sert de contrôle interne pour normaliser l’expression de la luciférase.
Ajouter l’inducteur pour initier l’expression des gènes, puis aliquote la culture dans une plaque multi-puits.
Introduire des concentrations croissantes d’une molécule d’essai dans des puits sélectionnés. Couver.
Dans des conditions de contrôle, une mauvaise traduction entraîne une sécrétion active de luciférase.
Si la molécule testée inhibe les erreurs de traduction, la sécrétion active de luciférase diminue.
Transférez les aliquotes de culture sur une plaque noire et mesurez la fluorescence de la GFP.
Centrifugeuse pour granuler les cellules.
Transférez les surnageants contenant la luciférase sécrétée et ajoutez le substrat, où la luciférase active catalyse son oxydation, produisant de la luminescence.
Mesurer la luminescence et calculer le rapport luciférase/GFP ; Un rapport plus faible indique une réduction des
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