Western Blot pour l’évaluation de l’intégrité structurelle d’un antigène vaccinal bactérien

Prenez un gel SDS-PAGE contenant des bandes protéiques à partir de particules de nanolipoprotéines membranaires. Ces complexes portent la protéine membranaire oligomérique de Chlamydia ou MP, un antigène vaccinal prometteur contre l’infection à Chlamydia.

Utilisez des bandes protéiques de MP oligomères purifiés comme contrôle.

Assemblez le gel, la membrane Western Blot et les composants de transfert dans un système de transfert sec.

Appliquez un courant électrique pour transférer les protéines résolues sur la membrane.

Retirez la membrane et incubez-la dans un tampon contenant des détergents et des anticorps primaires.

Les détergents bloquent les sites d’interaction non spécifiques, tandis que les anticorps primaires ciblent le MP.

Lavez la membrane pour éliminer les anticorps primaires non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores ciblant les anticorps primaires.

Lavez la membrane pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires.

Capturez des images de fluorescence de la membrane.

Des bandes moléculaires correspondant au MP oligomère de contrôle confirment l’intégrité structurelle du MP au sein des complexes, soutenant ainsi son potentiel antigénique.

Résoudre les échantillons à l’aide de la méthode SDS-PAGE et transférer les piles de gel à l’aide d’un système commercial de transfert sec pour l’analyse par transfert Western. Retirez les taches de la pile et incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans un tampon bloquant contenant 0,2 % de TWEEN 20 et 0,5 microgramme par millilitre de MAb40, ou 0,2 microgramme par millilitre d’anticorps MAbHIS antiHIS-tag dirigé contre le HIS-tag de la protéine delta-49ApoA1.

Lavez chaque tache avec du PBST trois fois pendant cinq minutes par lavage. Incuber les transferts pendant une heure dans un tampon bloquant contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dans une dilution de 1 à 10 000. Répétez les lavages avec PBST et capturez l’image à l’aide d’un imageur à fluorescence après le lavage final.