JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:54 min • October 30th, 2025
Commencez par une culture de cyanobactéries, qui sont des bactéries photosynthétiques.
Ces bactéries contiennent des gouttelettes de plastoglobules riches en lipides et des membranes thylakoïdes, qui sont des structures membraneuses repliées riches en pigments photosynthétiques.
Centrifugez la culture et jetez le surnageant pour éliminer les polysaccharides extracellulaires produits par les bactéries. Lavez le granulé, puis remettez-le en suspension dans un tampon.
Utilisez un homogénéisateur à haute pression pour générer une force de cisaillement, qui perturbe les parois cellulaires et les membranes.
La rupture des membranes thylakoïdes libère des pigments photosynthétiques dans le lysat. La libération de pigments provoque un changement de couleur qui indique une perturbation cellulaire et la libération de plastoglobules.
Chargez le lysat dans des tubes à centrifuger, puis ajoutez une solution de saccharose pour former un gradient de densité.
Centrifugeuse pour séparer les composants cellulaires par densité.
Le thylakoïde et d’autres composants plus lourds se granulent au fond, tandis que les plastoglobules de faible densité flottent vers le haut comme une bande distincte.
Recueillir la fraction de plastoglobule et la conserver par congélation pour une analyse plus approfondie.
Cultiver 50 millilitres de culture de l’espèce Synechocystis PCC 6802 dans un milieu BG11 pendant 7 à 10 jours pour atteindre la phase stationnaire.
À l’aide d’un spectrophotomètre, ajustez la densité cellulaire à une densité optique de 2,0 à 750 nanomètres. Pour éliminer les polysaccharides, centrifugez 50 millilitres de culture et retirez le surnageant. Répétez deux fois le lavage des cellules dans 50 millilitres de tampon A.
Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 millilitres de tampon A et brisez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française de 1 100 livres de pouces carrés. Répétez le processus trois fois dans des conditions froides jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge-bleu-vert sous lumière blanche. Prélever l’aliquote de l’homogénat de cellules et la mettre de côté pour qu’elle soit stockée en tant qu’échantillon total représentatif de cellules.
Répartissez l’homogénat obtenu dans huit tubes d’ultracentrifugation de trois millilitres remplis d’un maximum de 2,5 millilitres dans chaque tube. Superposez cet homogénat avec 400 microlitres de R moyen, produisant un gradient de marche. Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant du fluide R supplémentaire si nécessaire avant de centrifuger les tubes.
Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds, y compris les corps polyhydroxyalcanoates, montrent la formation de granulés, tandis que les plastoglobules forment un coussinet huileux jaune sur ou près du sommet du gradient de saccharose. Récoltez le tampon flottant de plastoglobules bruts obtenu à l’aide d’une seringue et déposez la récolte dans un tube de deux millilitres.
Grattez les plastoglobules sur le côté de la paroi du tube d’ultracentrifugation avec une pointe d’aiguille si nécessaire. Soit poursuivre le traitement des cyanobactéries, soit stocker les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et les purifier plus tard.