JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:03 min • October 30th, 2025
Commencer par une culture de Legionella pneumophila, une bactérie pathogène.
Ces cellules bactériennes possèdent un système de sécrétion sur leur membrane, ce qui est essentiel pour l’infection de l’hôte.
Mettez les cellules bactériennes en suspension dans de l’eau stérile pour obtenir la densité requise pour l’imagerie par tomographie électronique cryogénique (cryo-ET).
Ajoutez des nanoparticules d’or, qui servent de points de référence pour l’alignement de l’image lors de la reconstruction tridimensionnelle.
Prenez une grille avec un film de carbone perforé pour déposer l’échantillon bactérien.
Placez la grille à l’intérieur d’une chambre remplie de gaz et appliquez une décharge électrique pour rendre la surface plus hydrophile.
Appliquez la suspension sur la grille, permettant au liquide de se répartir uniformément sur la surface et aux cellules de se déposer.
Retirez l’excès d’eau de la grille et plongez-la dans un milieu de congélation liquide pour congeler l’échantillon et préserver son architecture cellulaire.
L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie cryo-ET du système de sécrétion bactérienne.
Pour préparer l’échantillon de cryotomographie électronique, faites pousser une épaisse tache de Legionella Pneumophila sur des plaques CYE-agar-streptomycine pendant 48 heures à 37 degrés Celsius.
Remettre les cellules en suspension dans l’eau à une OD600 d’environ 0,7. Ajoutez ensuite cinq microlitres de particules d’or colloïdal à 20 microlitres de suspension cellulaire. Glow décharge une grille de carbone trouée et pipette cinq microlitres du mélange de cellules dessus.
Laissez reposer pendant une minute. Épongez la grille avec du papier filtre et congelez-la dans de l’éthane liquide à l’aide d’un appareil à piston entraîné par gravité.