Transformation naturelle et expression de la GFP chez la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacuna

Prenez une culture de Phormidium lacuna, une cyanobactérie filamenteuse.

Homogénéiser la culture pour disperser les filaments, puis centrifuger pour granuler les bactéries.

Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu riche en nutriments.

Ajoutez de l’ADN plasmidique contenant de la protéine fluorescente verte et des gènes de résistance aux antibiotiques sur une plaque de gélose supplémentée en antibiotiques.

Ajoutez la suspension bactérienne sur l’ADN et incubez dans des conditions de lumière.

Les bactéries internalisent l’ADN à l’aide de pili de type IV. Les gènes introduits s’intègrent dans l’une des multiples copies du génome bactérien.

Redistribuez les bactéries sur une plaque de gélose enrichie en antibiotiques pour sélectionner les bactéries transformées.

Au microscope optique, identifiez les filaments sains et verts indiquant une transformation réussie.

Transférez les filaments sélectionnés dans un milieu liquide avec une concentration d’antibiotiques plus élevée pour enrichir la population transformée.

Encore une fois, placez-les sur de la gélose avec des niveaux d’antibiotiques plus élevés pour séparer les transformants.

Visualisez l’expression de la GFP au microscope à fluorescence pour confirmer la réussite de la transformation.

Commencez par inoculer 50 millilitres de milieu liquide F2 dans chacun des deux flacons de 250 millilitres avec un millilitre de filaments de P. lacuna provenant d’une culture en cours. Cultiver à la lumière blanche sous agitation pendant environ cinq jours à 25 degrés Celsius.

Après cinq jours, homogénéisez 100 millilitres de suspension de cellules de P. lacuna à 10 000 tr/min pendant trois minutes et mesurez la densité optique à 750 nanomètres. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire pendant 15 minutes à 6 000 fois g. Retirez le surnageant et suspendez la pastille dans 800 microlitres du liquide restant et du milieu F2+ supplémentaire. Prenez huit plaques de gélose F2+ Bacto contenant 120 microgrammes par millilitre de kanamycine et pipetez 10 microgrammes d’ADN au milieu de chaque plaque de gélose.

Pipetez immédiatement 100 microlitres de suspension cellulaire sur l’ADN. Gardez la plaque de gélose sans couvercle sur le banc propre pour permettre à l’excès de liquide de s’évaporer. Fermez l’assiette et cultivez-la à la lumière blanche à 25 degrés Celsius pendant deux jours.

Après deux jours, répartissez les filaments de chaque plaque de gélose sur plusieurs plaques de gélose F2+ Bacto fraîches contenant 120 microgrammes par millilitre de kanamycine avec une boucle d’inoculation. Cultivez les plaques à une lumière blanche à 25 degrés Celsius et vérifiez régulièrement les cultures au microscope. Après 14 à 28 jours, identifiez les filaments brunâtres morts et recherchez les filaments transformés au microscope.

Les filaments transformés ont l’air sains et verts et sont différents de la masse des filaments. Transférez chaque filament transformé dans des flacons de 50 millilitres avec 10 millilitres de milieu F2+ avec 250 microgrammes par millilitre de kanamycine. Cultivez sous une lumière blanche à 25 degrés Celsius sur un agitateur et observez la croissance jusqu’à quatre semaines.

Transférez les filaments dans le milieu gélosé contenant 250 microgrammes par millilitre de kanamycine et attendez que les filaments se développent. Ensuite, augmentez à nouveau la concentration de kanamycine pour accélérer la ségrégation. Pour l’expression de la GFP, observer les filaments uniques avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 40X ou 63X et capturer une image de transmission en fond clair et une image de fluorescence.