Mesures du flux d’oxygène pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules vivantes et perméabilisées

Chargez une suspension de cellules de mammifères dans des chambres de respiromètre contenant des fluides et scellez-les avec des bouchons pour créer un système fermé pour la mesure de l’oxygène.

Un capteur à l’intérieur de chaque chambre mesure le flux d’oxygène en temps réel, c’est-à-dire le taux de consommation d’oxygène cellulaire.

Injectez de la digitonine à travers les bouchons pour perméabiliser les membranes cellulaires, permettant aux composants cytosoliques de se diffuser.

Cela réduit la disponibilité du substrat pour la chaîne de transport d’électrons mitochondrial, ce qui réduit le flux d’oxygène.

Introduisez du pyruvate et du malate, qui pénètrent dans les mitochondries et génèrent des porteurs d’électrons.

Ces transporteurs donnent des électrons aux complexes I et II de l’ETC, initiant le transfert d’électrons et augmentant le flux d’oxygène.

Injectez de l’ADP pour initier la synthèse de l’ATP, ce qui augmente encore le flux d’oxygène.

Ensuite, titrez un découpleur par étapes pour perturber le gradient de protons, maximisant ainsi le flux d’oxygène.

Enfin, injectez de l’antimycine A pour inhiber le complexe III, arrêtant le transport d’électrons et minimisant le flux d’oxygène.

Ce profil de flux révèle la respiration mitochondriale dans les cellules perméabilisées.

Pour commencer, ajoutez le milieu de respiration mitochondriale MiR05 dans la chambre Oroboros propre. Insérez le bouchon pour fermer la chambre et siphonnez l’excès de fluide du réceptacle du bouchon à l’aide du système d’aspiration.

Avant d’ajouter les cellules HEK 293T, calculez le volume de suspension de stock de cellules nécessaire pour atteindre une concentration expérimentale de 1 million de cellules par millilitre.

Ensuite, retirez le bouchon de la chambre et placez-le sur le support. À l’aide d’une pipette, prélever un volume de MiR05 Vout de la chambre correspondant au volume calculé de la suspension de la crosse cellulaire.

Après avoir soigneusement remis en suspension la suspension de la crosse cellulaire à l’aide d’une pipette, ajoutez le volume calculé dans la chambre.

Pour fermer la chambre, insérez le bouchon en vous assurant qu’aucune bulle n’est piégée à l’intérieur. Siphonnez tout excès de liquide du réceptacle d’arrêt avec le système d’aspiration.

Attendez la stabilisation du flux d’oxygène, ce qui prend généralement environ 15 minutes.

Les traces de flux d’oxygène sont affichées dans le panneau supérieur des deux chambres, tandis que la concentration d’oxygène est affichée dans le panneau inférieur.

Pour préparer les microseringues, sélectionnez et nettoyez celle qui convient en fonction du type de produit chimique et du volume à titrer. Placez la microseringue sur le support à seringues.

Maintenant, chargez la seringue avec le produit chimique selon le protocole de titrage substrat-découpleur-inhibiteur de substrat respiratoire ou SUIT, en évitant les bulles de gaz. Remplissez la seringue avec au moins 1 microlitre de plus que le volume requis.

Appuyez sur le piston jusqu’à ce que le repère souhaité sur le cylindre en verre soit atteint, en veillant à ce qu’une petite goutte apparaisse à la pointe de l’aiguille. Essuyez la goutte sur la paroi du flacon chimique avant de procéder au titrage.

Lors de l’exécution du titrage, l’aiguille doit être insérée complètement à travers le capillaire du bouchon jusqu’à ce que l’extrémité du cylindre en verre soit en contact avec le bouchon, et le produit chimique doit être injecté rapidement dans la chambre.

Pour démarrer ce protocole SUIT particulier, ajoutez de la digitonine à une concentration expérimentale de 5 microgrammes par millilitre dans les deux chambres. Ensuite, cliquez sur OK dans la fenêtre d’événement pour définir l’événement correspondant pour les deux chambres.

Siphonnez l’excès de liquide du réceptacle du bouchon. Attendez la stabilisation du flux d’oxygène et enregistrez pendant au moins 2 minutes.

Titrer le pyruvate dans les deux chambres, puis le malate pour atteindre les concentrations expérimentales respectives. Cliquez sur OK dans la fenêtre de l’événement.

Maintenant, siphonnez l’excès de liquide du réceptacle d’arrêt, attendez la stabilisation du flux et enregistrez pendant environ 2 minutes.

Ensuite, ajoutez ADP à une concentration expérimentale de 2,5 millimolaires et cliquez sur OK dans la fenêtre d’événement.

Après avoir éliminé l’excès de liquide, attendez la stabilisation du flux. Le flux peut prendre jusqu’à 20 minutes pour se stabiliser.

Ensuite, répétez le processus avec CCCP par incréments de 0,5 micromolaire pour atteindre le flux maximal.

Ajoutez de l’antimycine A pour atteindre une concentration expérimentale de 2,5 micromolaires.

Après avoir atteint la stabilisation du flux, cliquez sur le bouton intitulé Arrêter la mesure.

Pour l’analyse des données, passez de la superposition à des chambres séparées. Fixez des marques sur des sections stables et représentatives du diagramme de flux, en évitant les artefacts de titrage.

Sélectionnez Repères dans le menu supérieur, puis choisissez Statistiques de repères. Sélectionnez la médiane dans le menu déroulant « mode statistiques » et cliquez sur Copier dans le presse-papiers pour transférer les données pour une analyse plus approfondie.