Mesures du flux d’oxygène pour évaluer la respiration mitochondriale dans les cellules vivantes et perméabilisées

Chargez une suspension de cellules de mammifères dans des chambres de respiromètre contenant des fluides et scellez-les avec des bouchons pour créer un système fermé pour la mesure de l’oxygène.

Un capteur à l’intérieur de chaque chambre mesure le flux d’oxygène en temps réel, c’est-à-dire le taux de consommation d’oxygène cellulaire.

Injectez de la digitonine à travers les bouchons pour perméabiliser les membranes cellulaires, permettant aux composants cytosoliques de se diffuser.

Cela réduit la disponibilité du substrat pour la chaîne de transport d’électrons mitochondrial, ce qui réduit le flux d’oxygène.

Introduisez du pyruvate et du malate, qui pénètrent dans les mitochondries et génèrent des porteurs d’électrons.

Ces transporteurs donnent des électrons aux complexes I et II de l’ETC, initiant le transfert d’électrons et augmentant le flux d’oxygène.

Injectez de l’ADP pour initier la synthèse de l’ATP, ce qui augmente encore le flux d’oxygène.

Ensuite, titrez un découpleur par étapes pour perturber le gradient de protons, maximisant ainsi le flux d’oxygène.

Enfin, injectez de l’antimycine A pour inhiber le complexe III, arrêtant le transport d’électrons et minimisant le flux d’oxygène