Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 2:54 min • November 28th, 2025
Prenez une suspension de cellules bactériennes exprimant une protéine cible marquée par la polyhistidine.
Sonicez sur glace pour minimiser la dégradation des protéines. Les ondes sonores à haute fréquence lysent les cellules, libérant le contenu intracellulaire, y compris la protéine cible.
Centrifugez pour séparer les débris et transférer les protéines contenant le surnageant dans une seringue.
Filtrez le surnageant pour éliminer les agrégats et éviter l’obstruction de la colonne chromatographie.
Prenez une colonne de chromatographie d’affinité à base de nickel et équilibrez-la pour une purification optimale des protéines.
Chargez le filtrat sur la colonne. La marque polyhistidine se lie aux ions nickel sur la résine colonne, immobilisant les protéines cibles.
Lavez la colonne avec un tampon pour éliminer les protéines non liées, et surveillez l’absorption UV de l’éluat pour confirmer leur élimination des protéines non ciblées.
Ajoutez un tampon d’élution contenant de l’imidazole, qui concurrence la marque polyhistidine pour la liaison au nickel, libérant ainsi les protéines.
Un second pic d’absorption UV confirme l’élution de la protéine cible, prête à être utilisée en aval.
Sonicez les c
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