JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:54 min • November 28th, 2025
Prenez une suspension de cellules bactériennes exprimant une protéine cible marquée par la polyhistidine.
Sonicez sur glace pour minimiser la dégradation des protéines. Les ondes sonores à haute fréquence lysent les cellules, libérant le contenu intracellulaire, y compris la protéine cible.
Centrifugez pour séparer les débris et transférer les protéines contenant le surnageant dans une seringue.
Filtrez le surnageant pour éliminer les agrégats et éviter l’obstruction de la colonne chromatographie.
Prenez une colonne de chromatographie d’affinité à base de nickel et équilibrez-la pour une purification optimale des protéines.
Chargez le filtrat sur la colonne. La marque polyhistidine se lie aux ions nickel sur la résine colonne, immobilisant les protéines cibles.
Lavez la colonne avec un tampon pour éliminer les protéines non liées, et surveillez l’absorption UV de l’éluat pour confirmer leur élimination des protéines non ciblées.
Ajoutez un tampon d’élution contenant de l’imidazole, qui concurrence la marque polyhistidine pour la liaison au nickel, libérant ainsi les protéines.
Un second pic d’absorption UV confirme l’élution de la protéine cible, prête à être utilisée en aval.
Sonicez les cellules sur la glace en utilisant cinq cycles d’impulsion de 15 secondes et une pause de 30 secondes.
Après centrifugation du lysat cellulaire à 21 000 g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, filtrez le surnageant à l’aide d’un système de filtration à seringue stérile. Utilisez un système de purification automatisé, équipé d’une colonne d’affinité à base de nickel de cinq millilitres pour purifier la fraction RTA marquée HIS du surnageant filtré stérile à E. coli. En général, utilisez une vitesse d’épultion d’un millilitre par minute et refroidissez tout le système de purification pour éviter une liaison inefficace des toxines et la perte d’activité toxique.
Équilibrez brièvement la colonne d’affinité avec 20 millilitres de tampon de liaison pour retirer le tampon de stockage. Ensuite, appliquez le surnageant stérile et filtré sur la colonne d’affinité à l’aide d’une seringue. Lavez la colonne avec 25 à 35 millilitres de tampon de liaison pour éliminer les protéines non liées de la colonne.
Effectuez l’étape de lavage jusqu’à ce que l’absorption UV à 280 nanomètres soit proche de la valeur UV initiale. Ensuite, éluvez la fraction liée de RTA avec 20 à 35 millilitres de tampon d’élution et conservez l’échantillon sur la glace. Il est important de commencer l’échantillonnage de la fraction RTA peu après l’augmentation de la valeur UV 280 et d’arrêter l’échantillonnage de la fraction RTA lorsqu’elle atteint à nouveau la base initiale.