Isolement des endospores à partir d’un échantillon environnemental par lyse ciblée de cellules végétatives

Prélève un échantillon environnemental contenant des cellules végétatives et des endospores d’une bactérie formatrice d’endospores, ainsi que d’autres bactéries.

Les endospores possèdent une couche protectrice qui les aide à survivre dans des conditions difficiles.

À l’aide d’une unité de filtration sous vide, filtrez l’échantillon pour piéger les cellules et les endospores sur une membrane.

Placez la membrane dans un plat et coupez-la en petits morceaux.

Transférez les morceaux dans un tube, ajoutez un tampon, puis agitez le tube pour libérer les cellules et les endospores.

Incubez avec agitation à haute température pour affaiblir les structures cellulaires végétatives sans endommager les endospores.

Refroidissez l’échantillon, puis ajoutez la lysozyme et incubez avec agitation. Le lysozyme perturbe la paroi cellulaire des cellules végétatives, provoquant leur rupture.

Ajoutez de l’hydroxyde de sodium et un détergent, puis incubez pour dégrader les macromolécules cellulaires et les débris tout en préservant les endospores résilientes.

Filtrez l’échantillon pour isoler les endospores. Lavez les endospores pour éliminer l’excès de réactifs, en les préparant à une analyse ultérieure.

Une fois l’unité de filtration et la pompe à vide préparées selon le protocole texte, utilisez des pinces stérilisées à l’éthanol pour ajouter une membrane de nitrocellulose stérile à l’unité de filtration. Ajoutez la moitié de l’échantillon surnageant préparé sur l’unité de filtration membranaire et utilisez la pompe à vide pour collecter les cellules de la membrane. Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêtez la pompe à vide.

Utilisez des pinces stérilisées pour retirer soigneusement la membrane et la placer dans une boîte de Petri stérile. Avec un nouveau morceau de membrane stérile, répétez la filtration avec la moitié restante de la solution. Pour séparer les endospores des cellules végétatives de la biomasse fraîchement collectée, décongeler la membrane si elle a été congelée, puis utiliser des ciseaux stérilisés à l’éthanol pour la découper en morceaux plus petits.

Transférez les morceaux de membrane dans un tube stérile de deux millilitres et ajoutez 900 microlitres de tampon 1X TE. Mélangez soigneusement en vortex pour libérer la biomasse de la membrane. Incubez le tube à 65 degrés Celsius et 80 tours par minute pendant 10 minutes.

Ensuite, retirez le tube de l’incubateur et laissez-le refroidir pendant 15 minutes. Ajoutez 100 microlitres de lysozyme fraîchement préparée à une concentration finale de deux milligrammes par millilitre et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius et 80 tr/min pendant 60 minutes pour lyser les cellules végétatives. Après la lyse, ajoutez 250 microlitres de 3 solutions normales d’hydroxyde de sodium et 250 microlitres de solution SDS à 6 % à l’échantillon. Incubez à température ambiante et à 80 tours par minute pendant 60 minutes.

Ensuite, préparez une unité de filtration stérile qui maintient des membranes de 25 millimètres de diamètre par autoclavage. Après refroidissement de l’unité de filtration, placez dessus une membrane de nitrocellulose de 25 millimètres de diamètre et 0,2 micromètre.

Ajoutez l’échantillon à la membrane et utilisez la pompe à vide pour filtrer le liquide, capturant les endospores sur la membrane, tandis que le matériau cellulaire végétatif passe.