Blocage de réplication médié par une protéine répressive marquée fluorescentement dans Escherichia coli

Prenons une culture génétiquement modifiée d’E. coli exprimant un réseau opérateur de tétracycline chromosomique (tetO).

Les bactéries portent également un plasmide doté d’un promoteur induisible par l’arabinose qui favorise l’expression de la protéine répressrice tétracycline marquée YFP.

Transférez la culture dans un milieu nutritif enrichi contenant des antibiotiques, puis incubez en secouant pour sélectionner des cellules contenant des plasmides.

À mesure que les cellules grandissent, les réresponsomes se forment et initient la réplication de l’ADN chromosomique.

À la phase exponentielle, on collecte une portion comme contrôle non induit.

Ajoutez l’arabinose, un inducteur, à la culture restante et incubez les deux cultures en secouant.

Dans la culture non induite, le dimère AraC reste lié à la boucle d’ADN, inhibant l’expression du répresseur.

Dans la culture induite, l’arabinose se lie au dimère AraC, induisant une expression répressive.

Les protéines répresseurs se lient à l’ensemble chromosomique tetO, stoppant la progression de la fourche de réplication.

Utilisez la microscopie à fluorescence pour observer les deux cultures.

Les foyers fluorescents dans la culture d’E. coli induite c