JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 2:48 min • November 28th, 2025
Prenez un mélange maître contenant une polymérase d’ADN déplaçant les brins, des nucléotides et un colorant double brin liant l’ADN pour l’amplification isotherme médiée par boucle ou LAMP.
Ajoutez des amorces contenant une séquence complémentaire inversée spécifique au gène bactérien ciblé.
Distribuez le master mix dans les tubes.
Ajoutez des échantillons contenant des gabarits d’ADN bactérien dans les tubes.
Placez les tubes à l’intérieur d’un instrument LAMP.
La dénaturation initiale permet à l’amorce de se lier à l’ADN cible.
Lorsque l’ADN polymérase déplaçant le brin commence à synthétiser un nouveau brin, elle déplace le brin existant, éliminant ainsi le besoin de cycle thermique.
Le produit amplifié forme une structure en boucle due à l’appariement inverse-complémentaire.
Cette structure contient plusieurs sites de départ pour le cycle suivant, facilitant l’amplification exponentielle de l’ADN cible.
Le colorant se lie à l’ADN amplifié et émet de la fluorescence.
Surveillez la fluorescence en temps réel pour détecter la présence du gène bactérien cible dans les échantillons.
Séparez physiquement les zones utilisées pour préparer le LAMP Master Mix et ajouter les modèles d’ADN.
Nettoyez les surfaces de travail avec de l’isopropanol et une solution dégradant l’ADN et la DNase. Ensuite, nettoyez les pipettes et les porte-bandes à tubes. Décongelez le mélange isotherme Master, le mélange 10X Primer, l’eau de qualité moléculaire, l’ADN témoin positif et les gabarits d’ADN à température ambiante.
Allumez l’instrument LAMP et entrez les informations d’échantillon pertinentes. Préparez le LAMP Master Mix selon les instructions du manuscrit, faites un vortex et centrifugez-le brièvement, puis distribuez 23 microlitres de Master Mix dans chaque puits d’une bande tubulaire. Manipulez tous les modèles d’ADN par un vortex et centrifugez-les brièvement.
Ensuite, ajoutez deux microlitres de gabarit d’ADN au puits approprié, et bouchez le puits fermement. Retirez la bande de tube du porte-tube, puis faites-la pivoter pour vous assurer que tous les réactifs se sont accumulés au fond du tube. Chargez la bande à tubes dans l’instrument LAMP, puis lancez la mise en marche LAMP.
Pendant que la réaction LAMP est en cours, appuyez sur les onglets Température, Amplification et Recuisson pour observer les changements dynamiques de divers paramètres pendant la sortie LAMP.