JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
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Commencez par une culture de Myxococcus xanthus, une bactérie du sol à croissance lente.
Inoculez une colonie dans un milieu complété d’un antibiotique.
Les cellules ont été conçues pour résister à l’antibiotique, garantissant que seules les bactéries désirées survivent.
Transférez la suspension dans une fiole plus grande contenant le milieu et incubez en secouant pour favoriser une croissance optimale.
Prenez une gaine de couverture montée sur un cadre métallique, qui assure un support mécanique lors de l’imagerie.
Distribuez la culture bactérienne dessus, puis ajoutez des microsphères fluorescentes pour servir de points de référence à l’alignement des images tout en acquérant plusieurs images.
Placez un coussinet d’agarose pré-chauffé contenant le substrat, puis recouvertez-le d’une housse pour maintenir l’hydratation.
Incubez pour permettre aux cellules d’adhérer au coussinet d’agarose.
Le pad fournit des nutriments aux cellules, permettant l’imagerie à long terme des processus cellulaires vivants lors de la prolifération dans la bactérie à croissance lente.
Pour commencer, re-suspendez une seule colonie de M. xanthus dans 500 microlitres de CTT à 1 %, complétés d’antibiotiques, dans un tube stérile et transférez l’ensemble de la suspension dans une fiole Erlenmeyer de 50 millilitres contenant cinq millilitres de CTT à 1 %. Préparez une solution de microscopie à 1 % d’agarose contenant 0,2 % de CTT en mélangeant un gramme d’agarose avec 80 millilitres de tampon TPM et 20 millilitres de milieu à 1 % de TCT. Faites passer la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit en fusion.
Remplissez une boîte de Petri avec environ 60 millilitres d’agarose fondue et laissez-la refroidir à température ambiante. Préchauffez le coussinet d’agarose à 32 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes avant utilisation. Ensuite, placez une housse en verre stérile sur un cadre en plastique ou en métal avec un trou au centre. Ensuite, utilisez du ruban adhésif pour fixer la bâche de couverture au cadre.
Ajoutez 10 à 20 microlitres de cellules de M. xanthus à croissance exponentielle sur la gaine. Pour ajouter des microspheres fluorescentes comme marqueurs fiduciaux des cellules, utilisez un tampon TPM pour diluer les microspheres à 1:100. Secouez soigneusement la suspension à billes et ajoutez cinq à dix microlitres aux cellules.
À partir du grand coussinet d’agarose préchauffé à 1 %, découpez un petit coussinet d’environ la taille de la housse de couverture et placez-le sur les cellules. Ensuite, placez une gaine de couverture sur le coussin pour éviter l’évaporation et maintenir les cellules dans un environnement humide. Incubez l’échantillon de microscopie à 32 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes pour permettre aux cellules de s’attacher au fond de la plaque d’agarose avant les enregistrements de la microscopie en accéléré.