Évaluation de l’activité des chaperones bactériennes via le dépliement thermique d’une protéine modèle

Commencez par placer une cuvette dans un spectrophotomètre à fluorescence équipé d’un porte-cuvette et d’un agitateur à température contrôlée.

Ajoutez un tampon préchauffé à un pH modérément acide et réglez la température du support pour simuler des conditions de stress.

Dans l’échantillon, ajoutez un chaperon anti-acide dérivé d’E. coli.

Dans l’échantillon témoin, ajoutez un volume de tampon équivalent.

Ensuite, introduisez une protéine substrat sensible à la température et à l’acide dans les deux échantillons.

Commencez à surveiller la diffusion de la lumière.

Incubez les échantillons sous des conditions de contrainte pour induire le dépliement du substrat.

Au pH modérément acide, la chaperone devient active et stabilise la protéine non repliée.

Ajoutez une solution de sel neutralisant le pH et continuez à enregistrer la diffusion de la lumière.

Dans l’échantillon témoin, le retour à un pH neutre provoque l’agrégation de la protéine non replie, augmentant la diffusion de la lumière.

Dans l’échantillon testé, la chaperonne favorise le repliement du substrat, ce qui réduit la diffusion de la lumière par rapport au témoin.

Comparez les signaux de diffusion de la lumière pour évaluer l’activité des accompagnateurs.

Placez une cuvette en quartz d’un millilitre dans un spectrophotomètre à fluorescence équipé de porte-échantillons et d’agitateurs à température contrôlée.

Réglez la longueur d’onde d’excitation et d’émission à 350 nanomètres. Ajoutez les volumes appropriés de tampon D préchauffé aux valeurs de pH souhaitées dans la cuvette. Le volume total est de 1 000 microlitres.

Réglez la température dans le porte-cuvette à 43 degrés Celsius. Ajouter 12,5 micromolaires HdeB au tampon, suivi de l’ajout de 0,5 micromolaire MDH. Commencez à surveiller la diffusion de la lumière.

Incuber la réaction pendant 360 secondes pour permettre un déploiement suffisant de la MDH. Augmentez le pH à sept en ajoutant un volume de 0,16 à 0,34 de phosphate dipotassium non tamponné à deux molaires et continuez à enregistrer la diffusion de la lumière pendant encore 440 secondes. Analysez les données telles que décrites dans le protocole texte.