Évaluation du rôle protecteur d’une chaperone activée par l’acide chez E. coli sous stress acide

Prenons les cultures recombinantes d’E. coli sensibles au stress environnemental.

La culture test contient un plasmide codant pour un chaperon activé par l’acide, tandis que la culture témoin ne contient que la colonne vertébrale plasmidique.

Inoculez les colonies individuelles dans des milieux riches en antibiotiques pour assurer la rétention des plasmides et incubez pour favoriser la croissance bactérienne.

Diluez les cultures dans un milieu frais contenant l’antibiotique et un inducteur pour activer l’expression de chaperones.

Faites pousser les cultures jusqu’à la phase mi-logarithmique, puis diluez pour obtenir une densité optique spécifique.

Ajoutez de l’acide pour faire baisser le pH, ce qui induit un stress acide.

Dans la culture testée, les conditions acides activent la chaperone, qui stabilise les protéines cellulaires et empêche leur agrégation. Dans la culture témoin, l’absence de chaperone provoque la dénature et l’agrégation des protéines cellulaires.

Ajoutez une base pour neutraliser le pH et stopper le stress acide.

Surveillez la croissance bactérienne en mesurant la densité optique au fil du temps.

Une croissance accrue dans la culture testée indique le rôle protecteur de la chaperonne lors du stress acide.

Préparez une culture nocturne à 50 millilitres de LB avec de l’ampicilline, puis cultivez les cellules à 200 tr/min et 30 degrés Celsius. Diluez les cultures pendant la nuit 40 fois en 25 millilitres de LB avec de l’ampicilline.

Faire croître la bactérie en présence de 0,5 % d’arabinose à 30 degrés Celsius et 200 tr/min jusqu’à une densité optique de 600 nanomètres, ou OD₆₀₀ égale à 1,0, pour induire l’expression de la protéine HDEB. Pour les expériences de décalage du pH, utilisez LB avec de l’ampicilline et de l’arabinose pour diluer les cellules à un OD_{de 600} de 0,5. Ajustez aux valeurs de pH respectives en ajoutant des volumes appropriés d’acide chlorhydrique cinq molaires.

Après les délais indiqués, neutraliser les cultures en ajoutant les volumes appropriés d’hydroxyde de sodium à cinq molaires. Surveillez la croissance des cultures neutralisées et de la culture liquide pendant 12 heures à 30 degrés Celsius en utilisant des mesures de OD.