Extraction d’ADN génomique à partir de tissu foliaire végétal infecté par des bactéries pathogènes

Prenez une feuille infectée par Candidatus liberibacter, une bactérie pathogène.

Découpez-le en morceaux, congelez-le instantanément dans de l’azote liquide, puis broyez-le pour rompre les cellules végétales et libérer leur contenu, y compris les bactéries.

Ajoutez un tampon de lyse des noyaux et mélangez soigneusement.

Incubez à haute température pour lyser les membranes, libérant l’ADN génomique des noyaux des plantes et des cellules bactériennes.

Ajoutez l’enzyme RNase, inversez le tube pour mélanger, puis incubez pour dégrader l’ARN.

Ajoutez une solution de précipitation protéique et mélangez pour favoriser l’agrégation des protéines. Centrifugeuse pour pelleter protéines et débris cellulaires.

Transférez le surnageant dans un tube contenant de l’isopropanol et mélangez pour précipiter l’ADN en brins visibles. Centrifugeuse pour pelleter l’ADN.

Lavez la granule avec de l’éthanol pour éliminer les impuretés, séchez à l’air libre et réhydratez l’ADN.

Incubez à haute température pour solubiliser l’ADN, puis chargez un échantillon dans une microcuvette.

À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la concentration d’ADN isolé.

D’abord, utilisez des ciseaux propres pour couper une feuille entière fraîche d’un agrume, et placez-les dans un sac plastique propre. Ensuite, refroidissez un mortier et pilon en ajoutant une petite quantité d’azote liquide. Ensuite, utilisez les ciseaux pour couper de petits morceaux de tissu foliaire, d’environ un pouce carré.

Placez les feuilles dans le mortier pour les congeler immédiatement. Commencez rapidement à broyer le tissu foliaire avec le mortier jusqu’à ce que l’azote liquide s’évapore, et qu’il reste une fine poudre verte. Ensuite, refroidissez une spatule métallique dans de l’azote liquide pendant 10 à 15 secondes. Ensuite, utilisez la spatule froide pour prélever le tissu moulu du mortier dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre.

Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour ajouter 600 microlitres de solution de lyse des noyaux à l’échantillon. Ensuite, faites passer l’échantillon en vortex pendant une à trois secondes. Couver le tube à 65 degrés Celsius, dans un bain-marie pendant 15 minutes.

Une fois la période d’incubation terminée, utilisez une pipette de 10 microlitres pour ajouter 3 microlitres de solution de RNase au lysat afin d’éliminer l’ARN. Ensuite, mélangez le contenu du tube en le retournant deux à cinq fois.

Incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un incubateur en armoire. Après 15 minutes, ajoutez 200 microlitres de solution de précipitation protéique à l’échantillon. Faites passer le tube à grande vitesse pendant 20 secondes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000 g pendant trois minutes.

Au cours de la centrifugation, ajoutez 600 microlitres d’isopropanol maintenus à température ambiante dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant du tube de centrifugeuse vers le tube contenant de l’isopropanol. Jetez la pastille.

Inversez le tube pour que l’ADN soit visible, comme un brin filineux. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000 g pendant une minute à température ambiante.

Décante le surnageant après centrifugation. Ensuite, ajoutez 600 microlitres d’éthanol à 70 % au pellet. Inversez le tube plusieurs fois pour laver la pellete.

Centrifugez le tube à 13000 g pendant une minute. Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant. Ensuite, inversez le tube avec le couvercle ouvert sur un papier absorbant pour le faire sécher à l’air libre pendant 15 minutes.

Une fois séché, ajoutez 100 microlitres de solution de réhydratation à l’ADN au pellet. Incubez la suspension d’ADN à 65 degrés Celsius dans un bain-marie pendant une heure. Tapotez le tube périodiquement pendant le mélange.

Ajoutez 1 microlitre d’eau purifiée dans une micro-cuvette. Lisez l’eau comme un blanc sur le spectrophotomètre. Ensuite, ajoutez 1 microlitre de l’échantillon dans la microcuvette. Placez la microcuvette sur le spectrophotomètre et obtenez la concentration d’ADN.